内生真菌对金线莲栽培生长发育的影响研究

杨开兴

(邵武将石省级自然保护区管理处，福建 邵武 354000)

1 引言

金线莲是一种兰属多年生草本植物，是能够全草入药的具有清热解毒、祛风祛湿等功效的名贵中草药。随着中医药研究的深入有效应用于高血压、糖尿病、心脏病、肺炎、肝炎等慢性高发病率疾病的控制治疗中，具有独特疗效。自然生长条件下的金线莲因对生长环境要求较高，导致生长缓慢，加之金线莲生长环境遭到人为破坏和随意采挖，野生的金线莲数量稀少，难以满足现代疾病治疗的需求[1]。兰科植物种子细小，并且使用人工无性繁殖难度系数高，虽然试管培养初见成效，但是组培苗出瓶栽培困难依据很多。分析自然界兰科植物的生长环境可知，所有的兰科植物都与真菌共生，真菌通过自身的生长代谢为兰科植物提供生长所必须的碳水化合物[2]。金线莲的生长发育与内生真菌密不可分，内生真菌能够促进金线莲形态发育、体内代谢产物累积，提高植物抗性，对金线莲的生长、代谢、抗病性和品质有着非常重要的影响。由于金线莲根际真菌环境复杂，不同种类的共生真菌对金线莲的促进效应具有潜在特异性。

基于以上内容，本文将从野生金线莲根际分离内生真菌，回接金线莲组培苗进行人工栽培。通过观察组培苗的生长态势，探究内生真菌对金线莲栽培生长发育的影响，为提高人工栽培金线莲的内在质量提供实验依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

本次实验选择来自4个不同产地的野生金线兰植株各5株，作为金线莲内生真菌的分离和纯化的操作对象。金线莲生长培养影响研究材料为无菌实验室中人工栽培的无菌试管苗共60株，无菌试管苗的苗高2～3 cm，根长0.5～1.5 cm。

野生金线莲内生真菌菌株的筛选仪器和试剂：超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、净水器、光照培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、生物显微镜、离心机、含蔗糖和琼脂的MS培养基、无水乙醇以及试管、锥形瓶若干[3]。

内生真菌影响金线莲组培苗生长发育测试用到的仪器和试剂：超净工作台、立式压力蒸汽灭菌器、光照培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、硝酸铵、硝酸钾、硫酸镁、肌醇、无水乙醇、蔗糖、琼脂、不含蔗糖和琼脂的MS培养基以及培养皿、锥形瓶若干[4]。

2.2 实验菌株的分离和纯化

选用来自4个不同产地的新鲜野生金线莲植株作为实验菌株提供来源。去除新鲜野生金线莲的根、茎、叶表面的泥土、腐烂叶片、杂草等杂质，并在自来水下冲洗干净。用无菌滤纸吸干金线莲植株表面的水分，分别针对植株的根、茎、叶进行表面消毒处理。按照1 min 75%乙醇、4 min 2.5%次氯酸钠、1 min 75%乙醇的顺序对于金线莲植株的根部表面进行消毒；按照1 min 75%乙醇、3 min 2.5%次氯酸钠、1 min 75%乙醇的顺序对于金线莲植株的茎进行消毒；按照1 min 75%乙醇、1 min 2.5%次氯酸钠、30 s 75%乙醇的顺序对于金线莲植株的叶片表面进行消毒[5]。

对金线莲的根、茎、叶表面消毒后，无菌水冲洗4次并吸干表面水分。使用无菌工具在不同金线莲植株的各个部位取一定大小的组织块，将组织块放在青霉素浓度为50 mg/L的PDA培养基中。在25℃的恒温环境下培养真菌[6]。当培养基中的组织块切面长出肉眼可见的菌落后，挑取菌丝于干净的PDA培养基中培养，重复挑取培养步骤，得到纯化后的金线莲内生真菌菌株。将不同菌落的内生真菌菌株标号，以便于后期分析。

2.3 菌株转接至金线莲组培苗处理

金线莲组培苗在分化培养基中进行分化培养，通过调整培养基内的营养成分含量，得到处于瓶苗、小苗、中苗三个不同分化时期的金线莲组培苗[7]。

金线莲组培苗与内生真菌的共培养配置组分为：825 mg/L的硝酸铵、950 mg/L硝酸钾、185 mh/L的硫酸铵、100 mg/L的肌醇、蔗糖15 g/L、琼脂14 g/L，将上述组分融合后调整pH值为5.8。以上无机培养组分占培养基基体成分的1/3，剩余2/3为MS培养基的有机成分[8]。

将纯化后的金线莲内生真菌菌株按照不同菌株种类分别接种至培养瓶中央，在培养瓶中与金线莲组培苗共培养。设置不接种内生真菌菌株只培养金线莲组培苗作为对照空白组[9]。将共培养的内生真菌菌株和金线莲组培苗放置在24～26 ℃、光照强度为1500 lux、光照周期为12 h的条件下，培养14 d，每天观察内生真菌及组培苗的生长状况。14 d后，移栽继续种植。

2.4 不同时期金线莲组培苗处理

将所有共培养金线莲组培苗中成活的苗按照不同苗期进行移植栽培处理。将成活的瓶苗炼苗，并用在120 ℃高压2 h灭菌后的苔藓植入穴盘中种植。移植前称量瓶苗鲜重，移植后150 d统计移植苗的成活率、成活苗的鲜重[10]。

将腐殖质和蛭石按照3∶1的比例，并混入一定量的栋树叶片和固态菌株配置为小苗和中苗的盆栽基质。将配置好的盆栽基质等量装入盆口直径为10 cm、盆底直径6 cm,盆高7 cm的带孔花盆中。将共培养后的小苗和中苗的固体培养基成分冲洗干净，并消毒小苗和中苗的根、茎、叶表面。将花盆中的基质浇水后，按照小苗每盆2株、中苗每盆1株的标准分别移栽小苗和中苗。将移栽后的金线莲放入温室中，在温度为24 ℃、湿度93±1%、光照强度为1300 lux的条件下培养盆栽苗[11]。金线莲苗体移栽前，称量苗体鲜重，并在培养100 d后，统计移植苗的成活率、成活苗的鲜重。

2.5 统计学处理

3 结果与分析

在对实验菌株的分离和纯化过程中，共获取5种金线莲内生真菌。将4种金线莲内生真菌分别标记为01～05号菌。将内生真菌与不同生长周期的金线莲共培养，观察金线莲生长状态，统计金线莲生长相关数据并分析处理后得到相应结论。

3.1 内生真菌对金线莲瓶苗的生长发育影响

金线莲瓶苗和不同种类内生真菌共培养150 d，在培养期间，实验组和对照组金线莲瓶苗的生长数据，以及培养结束后，两组金线莲苗的干重增加量、苗高增加量、鲜重增加量、气生根和基生根数量变化数据如下表所示，分析表1中数据，研究内生真菌对金线莲瓶苗的生长发育影响。

表1 内生真菌对金线莲瓶苗的生长发育影响数据

经过统计计算，与内生真菌共培养的金线莲植株的成活率为96.2%，对照组未与内生真菌共培养的金线莲植株的成活率为43.7%。从与内生真菌共培养的金线莲植株共生基表面部分呈现的形态上来看，在02和03号菌的作用下，金线莲瓶苗的生长速度处于本次实验所有组别的中的偏下。02和03号菌的菌落在共培养60 d后，菌落约占培养基的1/2，与对照组金线莲植株相比较为粗壮，黄色叶片数量较少。与01和05号菌共培养的金线莲瓶苗生长速度最快，在共培养40 d后，01和05号菌的菌落长满整个培养基。但是与对照组瓶苗相比较，与01和05号菌共培养的金线莲瓶苗的黄叶相对较多。与04号菌共培养的金线莲瓶苗生长速度中等，菌落在共培养85 d时长满培养基，并且与04号菌共培养的瓶苗生长态势最好、气生根发达。与5种内生真菌共培养时，金线莲瓶苗的鲜重、干重都有显著提高。5种内生真菌对金线莲瓶苗的气生根有非常明显的促进作用，其中作用效果最佳的共生培养组相比增加了约43.8%。5种内生真菌对金线莲瓶苗基生根的促进作用有限，但相比对比组仍有所提升。

内生真菌对金线莲瓶苗的成活率有明显的促进作用，并且能够促进瓶苗气生根的发育、鲜重的增加，提高瓶苗的抗性。移栽后的瓶苗长势依旧良好，表明内生真菌能够保护金线莲生长、促进金线莲吸收营养物质。

3.2 内生真菌对金线莲小苗的生长发育影响

不同内生真菌与金线莲小苗共同培养后，在小苗盆栽阶段通过喷洒添加菌种的药剂对小苗重复接种相同种类的菌种。统计金线莲小苗的各项生长数据，具体的数据如表2所示。

表2 内生真菌对金线莲小苗的生长发育影响数据

验证组金线莲小苗在生长过程中继续喷洒不同种类的内生真菌溶剂，小苗移栽至花盆栽培的100 d内，验证组小苗的整体长势都好于对照组金线莲小苗。喷洒了内生真菌的小苗植株根、茎相比对照组更加粗壮，叶片数量明显多于对照组小苗，而且验证组金线莲小苗的黄叶数量少于对照组小苗。对于喷洒了不同种类内生真菌的对照组金线莲小苗，生长过程喷洒了01和04号内生真菌的小苗鲜重和干重增加量相比较多，且喷洒两种内生真菌的小苗气生根增加量较多。而实际的小苗生长状态也可发现，喷洒了两种真菌的小苗生长速度明显快于喷洒了其它种类菌种的小苗；喷洒02号和03号内生真菌的小苗生长速度、干鲜重增加量、气生根增加量都相比于对照组其它小苗较少，但是其基生根的增加量较多，整体小苗的根系在花盆中生长深度较深；喷洒05号内生真菌的小苗鲜重和干重增加量处于中等，气生根增加量较少，但相比其它对照组小苗，该组小苗的黄叶比例最低，植株高度虽相比较矮，但是植株的茎部相比更加粗壮。在100 d移植培养后，喷洒了01和04号内生真菌的小苗已经进入下一生长周期，植株生长态势优于喷洒其它种类真菌。综上所述，01和04号内生真菌能够有效缩短金线莲小苗的生长周期、促进小苗的快速生长；02号和03号真菌能够促进金线莲小苗基生根向栽培基质更深处生长；05号真菌能够促进金线莲小苗的茎、叶生长，使得植株茎部粗壮、叶片更加健康。

3.3 内生真菌对金线莲中苗的生长发育影响

不同组金线莲中苗在4种内生真菌的分别作用下，生长发育的具体数据如表3所示。分析表3中数据，结合植株生长情况，得出相应结论。

表3 内生真菌对金线莲小苗的生长发育影响数据

金线莲中苗在移植并喷洒不同内生真菌溶剂栽培100 d后，苗体长势略微优于对照组中苗的苗体长势，对照组之间对比，喷洒了03号真菌的金线莲中苗的长势相比较好。喷洒其它4种内生真菌的金线莲中苗生长态势相差不多。以上数据表明，在金线莲中苗的生长过程中，喷洒内生真菌的植株长势有一定提升，03号真菌的促进生长作用较强。

综合以上3组实验结果，内生真菌对金线莲中苗的生长作用非常有限，远不及对金线莲瓶苗、小苗生长发育的促进效果。

4 结语

内生真菌广泛存在于兰科植物中，为高质量、大规模地人工培养出品质良好的金线莲，本文研究了内生真菌对金线莲栽培生长发育的影响。在本次实验中提取的内生真菌对金线莲不同时期的植株生长都有一定的促进作用，但是野生金线莲根际微生物环境复杂，仍需要更多的研究数据为人工栽培金线莲提供理论支撑。为深入研究内生真菌对金线莲生长发育的影响，未来将进一步研究内生真菌复合作用以及数量对金线莲不同时期植株的生长发育影响。