骨素对软骨细胞及软骨组织修复的影响

【摘要】本研究目的是使用细胞生物学，组织形态学方法和免疫组化染色法确定骨素对软骨细胞及动物软骨损伤修复治疗效果。以人软骨细胞C28/12进行体外实验，发现10μg/mL的骨素对细胞的增殖效果最明显，达到112.75%且有显著性差异（P<0.05）。而100μg/mL的骨素对细胞分泌的透明质酸和“型胶原蛋白最高，分别达到0.7723±0.011△ng/mL、8.722±0.23△ng/mL（P<0.05）。利用家兔進行体内试验，结果显示骨素在软骨损伤修复上有非常好的效果，且对炎症因子（IL-1b、TNF-αa）及尿酸的分泌有很好的的抑制效果，同时对生长因子TGF-β分泌有促进作用。

【关键词】骨素;软骨细胞;软骨组织;炎症因子;尿酸

[中图分类号]R91 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）09-0001-02

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是世界范围内最普遍的疾病之一[1]，它是由外部因素（如创伤）或内在因素（如各种类型的分子功能障碍）导致的代谢失衡引起的。这种不平衡导致细胞因子和炎症介质的产生级联反应，进而释放一氧化氮（NO），导致软骨细胞凋亡和细胞周基质（ECM）退化[2]。

软骨细胞作为软骨组织唯一的细胞类型，表达和分泌大量软骨细胞周基质（ECM）维持软骨正常功能[3]，而软骨PCM主要是由Ⅱ型胶原和脂多糖PGs（HA、CS）组成。Ⅱ型胶原是骨型成型、软骨形成、骨骼成长和成熟软骨维持等所必须的;透明质酸（Hyaluronic acid，HA）则是体内蛋白多糖合成的重要组成部分，可以通过减少炎症介质的释放，同时延缓软骨损伤所导致的生物化学改变，抑制软渭基质进一步退变和降解，所以具有很强的持续性增强内源性软骨修复的效应。在关节炎症过程中，巨噬细胞释放细胞因子，如白介素IL-1β，IL一6和肿瘤坏死因子TNF-α，以及许多生长因子。这些细胞因子诱导基质金属蛋白酶（MMPs）[4]的表达，这些细胞因子可以消化ECM的大分子和不在ECM中的分子，如受体、生长因子、细胞因子和趋化因子[5]。

本研究的目的是使用细胞生物学，组织形态学方法和免疫组化染色法确定骨素对软骨细胞及动物软骨损伤修复治疗效果，从而对骨关节的保护起到一定的作用。

1 实验仪器与试剂

二氧化碳培养箱（Thermo），组织切片机（Thermo），组织包埋机（Thermo），酶标仪（Tecan），CCK-8，IL-1β，TNFα，TGF-β，人透明质酸（HA），人Ⅱ型胶原蛋白ELISA试剂盒，胎牛血清（Gibco），DMEM，软骨细胞C28/12，HE染液，石蜡，动物新西兰兔，雄性成年，2.5～3.3kg，36只（上海动物实验中心），YDJZ.11医用电动锯钻（上海慧恩），显微镜。

2 实验方法

2.1 骨素对软骨细胞C28/12增殖影响 将分离得到的软骨细胞C28/12，转入T25细胞培养瓶中，37℃培养，待生长至80%左右将软骨细胞C28/12离心回收，细胞计数仪计数，%孔细胞培养板每孔接入2.0～4.0×104个细胞，培养24h。待测样品配置成相应浓度，0.22μm滤膜过滤除菌。（1）实验分组，阴性对照：空白（不加骨素）样品浓度设置：骨素100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL（2）取样品目标浓度加入软骨细胞C28/12中37℃培养箱中培养，于24H后加10μl的CCK-8，37℃培养箱继续孵育1～4h，检测OD450值。

2.2 骨素对软骨细胞C28/12分泌人透明质酸和人Ⅱ型胶原蛋白分泌影响 细胞培养及样品处理和细胞增殖试验相同，实验分组如下：（1）阴性对照：空白（不加骨素和细胞）;样品浓度设置：骨素1000μg/mL，100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL;阳性对照：空白（不加骨素）。（2）取样品目标浓度加入软骨细胞C28/12中37℃培养箱中培养，于24H后、取上清，3000转离心20min，收集上清液。（3）按照试剂盒说明书，进行标准曲线的制备，同时按照说明书的步骤进行样品检测。

2.3 软骨缺失动物模型处理 软骨缺失家兔组织模型处理及分组，将家兔随机分为5组。对照组（A组）、模型组（B组）、低剂量骨素组（C组）、高剂量骨素组（D组）、硫酸软骨素（E组）。每组6只。造模后对损伤的关节进行复位，同时缝合伤口。对照组泽则不做任何处理。术后注射80万单位的青霉素钠，1次/天，连续3天，并在第5天强化一次，以防感染。术后第二天进行灌胃，每日一次（给药量按人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表计算）[6]。（1）对照组，每天灌胃等量蒸馏水，连续5周。（2）模型组，每天灌胃等量蒸馏水，连续5周。（3）给药组针对于实验动物组和阳性药物对照组，每天按剂量灌胃，分别为低剂量骨素按照0.2g/kg，高剂量骨素按照0.4g/kg，连续5周[7]。

2.4 骨素对软骨组织切片观察及炎症因子分泌影响 灌胃5周后，经耳缘静脉10%水合氯醛（2m1/kg）麻醉，用碘酒、乙醇消毒膝关节后，从骸上囊部位注射1mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS溶液）进入关节腔，反复活动关节后，抽取灌洗液[7]，做好标记采用ELISA法检测兔关节液中IL-1β、TNF-α和TGF-1β的水平;腹主动脉取血，4000r/min离心4min后取血清，采用HPLC法测定血清中尿酸的水平;在无菌条件下切开关节腔，取出关节并固定于10%甲醛固定液后，常规脱钙、冲洗、脱水、包埋和切片，HE染色处理，经光镜对切片进行病理组织学观察[8]。

3 实验结果

3.1 骨素促进软骨细胞C28/12增殖 实验结果中，把对照组的增值率设为100%，当骨素浓度为1μg/mL时，软骨细胞C28/12增值率为106.82%，而浓度分别为10μg/mL，100μg/mL时，增值率分别达到112.75%，106.15%且细胞的增值率有显著性差异（P<0.05），结果见图1。

图1 不同浓度骨素对软骨细胞C28/12增殖的影响

3.2 骨素促进软骨细胞C28/12分泌人透明质酸和人B型胶原蛋白分泌利用试剂盒中的标准品进行ELISA试验并测得标准曲线，通过标准曲线计算各组细胞液中的人透明质酸（HA）含量和人n型胶原蛋白含量。实验组和阳性对照有显著性差异（P<0.05），结果见表I。

表1 人透明质酸HA和人I Ⅰ型胶原蛋白分泌含量的变化（x±s）

3.3 病理组织学观察通过HE染色可以发现，家兔对的损伤部位，修复处可见明显的初期反应。模型组与骨素组在损伤处与对空白照组相比都有不同程度的修复，但通过对比观察可以发现模型组的修复相比骨素组要差，缺损处多事纤维组织和肉芽组织，软骨细胞较少，且排列较紊乱。给予骨素组后，损伤处被少量死骨，增生的成骨细胞及纤维组织填充，而且给予骨素后表面有增生的骨膜组织生成，表面软骨细胞平行排列，底部可见新生骨小梁。

图2不同浓度骨素对兔关节干预情况组织切片观察

3.4 骨素对软骨组织炎症因子分泌影响利用ELISA试剂盒对兔关节的灌洗液中的炎性因子（IL-Ip、TNF-司的分泌量进行检测，检测結果显示，模型组的炎症因子的分泌量较高，而给予骨素干预情况中，高浓度的骨素组炎症因子要比低浓度组的低并且两组都要低于模型组，同时高浓度的骨素组干预效果接近硫酸软骨素组;灌洗液中生长因子TGF-p也随着干预下有所提高，同时尿酸的含量在下降。 图3不同浓度骨素对兔关节干预情况下各因子分泌情况

4讨论

本研究初步验证了骨素对软骨细胞的增殖有明显效果，加速骨愈合过程。骨素对软骨的保护作用还体现在能够提高滑膜液产生透明质酸的能力，关节腔内正常透明质酸可以降低软骨面的蜕变，减轻骨性关节炎。骨素还可以减低骨关节损伤造成的炎症因子分泌，同时分泌大量TGF-p修复受损软骨组织。所以骨素在骨关节健康上有非常好的效果，也为骨关节疾病提供一个好的方向。

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北京：北京体育大学，2013.

作者简介：费维成，男，汉族，安徽滁州人，安徽农业大学微生物学硕士，日本广岛大学药学博±在读。辉文生物研发中心，安全与功效评价研究员。研究方向：化妆品与食品功效研究、微生物发酵和功能开发。