赤拟谷盗角蛋白KAP19-2基因参与磷化氢抗性发生机理

车美玲 孟宏杰 唐培安 王康旭

摘要：為探明角蛋白相关基因——KAP19-2在害虫磷化氢（PH3）抗性产生中的作用，以赤拟谷盗为研究对象，利用荧光定量PCR技术检测解析角蛋白相关基因KAP19-2在赤拟谷盗不同发育时期、不同抗性种群及PH3胁迫后的表达模式。定量结果表明：KAP19-2主要在刚羽化3 h后的成虫体内大量表达，是蛹期平均表达水平的22.79倍，与其他发育时期表达量均存在显著性差异；同时，该基因在抗性种群的表达量高于敏感种群，并具有显著性差异，其相对表达量与赤拟谷盗不同抗性种群的抗性倍数呈正相关。在PH3胁迫处理条件下，KAP19-2基因在敏感种群处理6 h后的相对表达量最低，在抗性种群处理20 h后的相对表达量最低。因此认为该基因参与PH3抗性形成。

关键词：赤拟谷盗；角蛋白；磷化氢抗性；KAP19-2

中图分类号：S379.5 文献标识码：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210225

赤拟谷盗（Tribolium castaneum）是一种危害性强的世界性储粮害虫，通过直接取食、粪便污染及加速霉变等方式对储粮进行危害。在储藏物害虫防治方面，磷化氢（PH3）具有高毒力、低残留、无植物毒性、使用方便等特点，是防治储藏物害虫性能最优良的熏蒸剂之一。赤拟谷盗在国内仓库通常使用PH3熏蒸处理进行防治，由于长期单一使用，导致赤拟谷盗PH3抗性日益严重，对国储粮安全构成重大威胁[1-4]。转录组学研究表明，赤拟谷盗不同PH3抗性种群基因表达量存在明显差异，其中包括角蛋白相关基因KAP19-2，该基因在赤拟谷盗PH3抗性种群为上调基因[4]，但其在PH3抗性行成中的功能尚不清楚。

角蛋白是纤维结构蛋白家族之一，它是构成头发、角、爪和人体皮肤外层的主要蛋白质。角蛋白可保护上皮组织细胞免受损伤或压力。角蛋白单体组成束以形成中间纤维蛋白[5]。早期研究认为中等纤维（Intermediate Filament，IF）仅存于脊椎动物细胞中[6]，陈新华等[7]通过免疫印迹等实验表明斜纹夜蛾和甜菜夜蛾细胞中的IF主要由角蛋白组成。角蛋白KAPs被认为是与毛质性状相关的蛋白家族，研究的对象集中于家兔、绵羊和人等，研究的内容多见于遗传多样性方面[8]。本实验采用荧光定量PCR技术探究赤拟谷盗KAP19-2基因的发育表达模式，预测特定基因在赤拟谷盗不同发育时期的作用及功能；分析该基因在PH3胁迫前后的表达模式，从分子生物学的角度验证相关基因在PH3抗性形成的作用，为揭示赤拟谷盗PH3抗性形成机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试虫源

本实验选用采自5个不同地区的赤拟谷盗种群，分别为苏州胥口（XK）、云南西双版纳（YN）、常德金健（JJ）、成都（CD）、深圳（SZ），并已在南京财经大学食品科学与工程学院储粮害虫实验室连续培养，试虫饲养和设备使用参照文献[3]描述的操作方式进行，试虫详细信息见表1。

1.1.2 主要试剂和仪器

HiScript？ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTM SYBR？ Qpcr Master Mix：南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Loading Buffer（Takara），50×TAE（Solarbio），Trizol？ Reagent（分析纯，Invitrogen），琼脂糖（HyAgarose），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇（分析纯），浓硫酸（优级纯），

Zn3P2。

7500型荧光定量PCR仪：赛默飞世尔科技有限公司；BSC-250型恒温恒湿培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Hamilton 7000型气密性注射器：北京英伟达科技有限公司；HL-200- PH3型PH3气体报警仪：北京佳粮科贸有限公司。

1.2 试虫处理

不同发育时期样本收集（供试虫源：XK）：将带有卵的饲料在适宜饲养条件下培养至孵化，收集足量（数百头）1龄幼虫，部分置于液氮中冷冻保存备用，其余幼虫置于添加饲料的培养皿中继续培养，待其蜕皮后，收集足量的2龄幼虫，按照上述方法保存及培养，依次收集足量的3、4、5龄幼虫，预蛹，5日龄蛹，羽化后3 h、7 d成虫（羽化7 d后，试虫发育趋于成熟[9] ）。每个样本均设3个生物学重复。

不同抗性种群样本收集（供试虫源：XK、YN、JJ、CD、SZ）：挑选羽化后7 d左右的赤拟谷盗成虫进行实验（无性别区分）。PH3气体制备：由Zn3P2粉末和10%的硫酸反应生成PH3气体，采用联合国粮农组织（FAO）推荐的PH3发生装置收集气体，气体发生装置见图1。使用PH3气体检测仪测定气体浓度。

PH3胁迫：对YN和SZ种群的试虫进行PH3胁迫处理。在生物测定的基础上，选择试虫的LC30作为PH3胁迫浓度，并设置不同的时间梯度，采用熏蒸法进行胁迫处理，具体方法：将每个种群至少50头羽化后7～10 d的成虫放入熏蒸瓶中，并密封，根据试虫的亚致死浓度，用气密性注射器抽取一定量的PH3气体（YN：17 μL；SZ：5 mL），分别注入各熏蒸瓶中，用蜡封注射口，然后将其置于温度（30±1）℃、湿度（75±5）%、无光照的培养箱中密闭熏蒸。分别处理1、2、6、12、20 h。PH3胁迫结束后，迅速挑选生理状态良好的赤拟谷盗，分别置于冻存管中，做好标记，并置于液氮中冷冻保存备用。以未处理（0 h）的试虫作为空白对照，每个处理设置3个生物学重复。

1.3 试虫总RNA的提取和cDNA第一链的合成

采用Trizol 法[10]提取上述收集和处理的试虫的总RNA，用酶标仪测定RNA浓度和纯度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否清晰完整，以便进行后续实验。然后按照HiScript？Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒说明书进行操作，合成cDNA，并放于-20 ℃冰箱保存。

1.4 內参基因的选择及定量PCR引物设计

参照文献[11]使用RPS6作为试虫不同发育时期定量实验的内参基因；选择双内参组合：RPS18和RPL13作为不同抗性种群试虫定量实验的内参基因。使用NCBI中的Primer-Blast设计用于荧光定量PCR的所有引物。定量引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。相关引物、内参基因序列见表2。

1.5 荧光定量PCR

荧光定量PCR反应采用ChamQTM SYBR？ qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）试剂盒，使用ABI 7500 PCR系统（Applied Biosystems，USA）进行qPCR，对角蛋白相关基因KAP19-2的相对表达量进行分析，实验中的每个种群设置3个生物学重复。每个荧光定量PCR反应对3个重复样品（生物重复）进行3次（技术重复），按照试剂盒说明书配制溶液，操作方法参考文献[3]。

1.6 基因引物筛选及验证

使用1%琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物长度和电泳条带数目判断引物是否有非特异性，使用ABI 7500 PCR系统（Applied Biosystems，USA）进行qPCR，根据熔解曲线的单一性判断引物的特异性。取样品的cDNA模板，将其依次稀释5个浓度梯度，测定并计算PCR扩增效率（E）和相关系数（R2）。扩增效率按式（1）计算。综合参考引物特异性验证的结果与引物扩增效率，最终筛选出用于荧光定量PCR的最佳引物。

E = （10-1/K-1） × 100% （1）

式中：E为扩增效率，%；K为标准曲线斜率。

1.7 数据处理与分析

实验结果用平均数±SD表示，运用SPSS 16.0软件进行数据分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOV）中的Turkey式多重比较法，对赤拟谷盗3条表皮相关基因在不同发育时期和不同组织的相对表达量进行差异显著性分析（P = 0.05，置信区间为95%）。

2 结果与分析

2.1 RNA质量分析

图2为提取的赤拟谷盗不同发育时期、不同种群赤拟谷盗的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。由图2可知，RNA条带清晰明亮，无弥散现象，酶标仪检测得OD260/OD280均在1.8～2.2的范围内，说明RNA完整性良好、未降解，可作为合成cDNA模板。

2.2 引物特异性验证和扩增效率分析

采用普通PCR扩增角蛋白KAP19-2基因和3个内参基因，并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，扩增片段符合预期，条带单一且清晰明亮，表明无引物二聚体等现象，所设计的引物具有特异性。使用ABI 7500 PCR系统对引物进行标准曲线和溶解曲线分析（图3），可以发现，每条引物的熔解曲线都是单一峰，且4对引物的相关系数在0.997～0.998，扩增效率在99.92%～102.70%（表3），符合PCR对特异性引物的试验要求，可用于后续定量试验。

2.3 赤拟谷盗KAP19-2基因在不同发育时期表达模式分析

赤拟谷盗角蛋白KAP19-2基因在试虫不同发育时期的相对表量如图4所示。角蛋白相关基因KAP19-2主要在刚羽化成虫期大量表达，是蛹期平均表达水平的22.79倍，与其他发育时期表达量均存在显著性差异（P<0.05）；其他发育时期表达量较少。

2.4 赤拟谷盗KAP19-2基因在不同PH3抗性种群的表达模式分析

赤拟谷盗角蛋白KAP19-2基因在不同PH3抗性种群的相对表达水平如图5所示。由图5可知，KAP19-2基因在抗性种群的表达量高于敏感种群且具有显著性差异（P<0.05），且该基因的相对表达量与抗性倍数呈正相关。

2.5 赤拟谷盗KAP19-2基因在PH3胁迫下的表达模式分析

敏感（YN）和抗性（SZ）种群赤拟谷盗KAP19-2基因在PH3胁迫前后的相对表达水平如图6所示。由图6可知：敏感种群KAP19-2基因处理1 h和6 h后，与未处理组（0 h）相比其相对表达量显著下降（P<0.05）。抗性种群KAP19-2基因经PH3处理不同时间后，其相对表达量呈先上升再下降的趋势，在处理20 h时出现最低值，相比未处理组（0 h）差异显著（P<0.05）；该基因在胁迫前后的相对表达量无显著性差异（P>0.05）。PH3胁迫对该基因在敏感和抗性种群中的表达模式具有不同的影响。

3 讨 论

赤拟谷盗角蛋白相关基因KAP19-2主要在羽化3 h的成虫期大量表达，在其他发育时期表达量较低，幼龄成虫到羽化3 h的成虫阶段KAP19-2表达量上升了近44倍。转录组学研究表明该基因在赤拟谷盗磷化氢抗性种群中为上调基因，并有研究[12]猜测该基因在节肢动物中促进入侵微生物在损伤部位的固定。赵濛等[8]研究发现阿尔巴斯白绒山羊KAP3.1基因在毛囊兴盛期较低表达，在退行期前表达量达到顶峰，退行期后表达水平逐渐降低，说明此类基因在生长过程中表达量均会发生明显变化，猜测KAP19-2在赤拟谷盗生长过程中发挥了作用。

赤拟谷盗角蛋白相关基因KAP19-2在磷化氢抗性种群中表达量呈上调趋势，在抗性种群的相对表达量显著高于敏感种群。由此推测，KAP19-2可能参与了赤拟谷盗磷化氢抗药性的形成。角蛋白具有很强的抗牵张性能，在动物体内起保护作用[13]。金梅等[14]发现可以通过外源干扰，在毛囊发育的不同时期利用K26及KAP26.1基因过表达对其他基因的影响调控绒毛细度，影响发育周期。KAP19-2和KAP26.1属于同一个家族的角蛋白关联蛋白，其功能可能相似，均影响了动物的正常发育。为了进一步验证KAP19-2基因是否介导赤拟谷盗磷化氢抗药性的形成，利用荧光定量PCR技术对磷化氢敏感和抗性种群赤拟谷盗KAP19-2基因在磷化氢胁迫前后的表达量进行分析，结果表明：受磷化氢胁迫后KAP19-2在敏感种群中的表达量呈波动变化，无明显规律；在抗性种群中总体呈现先上升后下降的趋势，在2 h相对表达量达到峰值，提示磷化氢胁迫可能对抗性种群具有一定诱导作用，但是长时期诱导后表达量迅速下降，可能会使抗性种群对磷化氢敏感，降低抵御磷化氢毒性的能力，这有待进一步的研究。

参 考 文 献

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Keratin Related Gene KAP19-2 of Tribolium Castaneum Participates in the Mechanism of Phosphine Resistance

Che Meiling， Meng Hongjie， Tang Peian， Wang Kangxu

（ School of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/Jiangsu Modern Grain Circulation and Security Coordination Innovation Center， Nanjing， Jiangsu 210023 ）

Abstract： To study the role of keratin-associated protein 19-2 （KAP19-2） in phosphine resistance of pests， this paper took T. castaneum as the research object， analyzed the expression pattern of keratin-related gene KAP19-2 in different development stages， different resistant populations and PH3 stress by Fluorescent quantitation PCR technology. The quantitative results showed that KAP19-2 was mainly expressed in adults just 3 hours after emergence， which was 22.79 times of the average expression level in pupal stage， and there were significant differences between KAP 19-2 and other developmental stages. At the same time， the expression level of the gene in the resistant population is higher than that in the sensitive population， and there is a significant difference， and its relative expression level is positively correlated with the resistance multiple of different resistant populations of T. castaneum. Under the condition of PH3 stress， the relative expression of KAP19-2 gene was the lowest in sensitive population after 6h treatment and the lowest in resistant population after 20 h treatment. Therefore， it is considered that this gene is involved in the formation of PH3 resistance， but its specific mechanism needs further study.

Key words： T. castaneum， keratin， phosphine resistance， KAP19-2