脑出血后继发性神经损伤发生过程中microRNAs调控作用机制的研究进展

曹洪涛，邹伟，于学平

1黑龙江中医药大学，哈尔滨150040；2黑龙江中医药大学附属第一医院神经内科

脑出血后继发性神经损伤是脑出血后常见的并发症之一，脑出血幸存者中，约有75%患者伴有继发性神经损伤，出现不同程度的运动、感觉、语言等继发性神经功能障碍［1-2］。脑出血后继发性神经损伤的发病机制复杂，多与脑出血发病早期血肿占位效应和潜在血肿扩张等原发性脑损伤及血脑屏障破坏、炎症、细胞凋亡、氧化应激等继发性脑损伤有关。

miRNAs是神经系统疾病发展中神经损伤的重要转录和转录后调节因子，其通过与多个靶标mRNA的3'非翻译区（UTR）结合，负向调节靶基因的表达，通过特定的RNA降解或整合来调节细胞的生理过程（包括细胞增殖、分化、凋亡、代谢等）［3-5］。近年研究发现，外源性microRNAs（miR‑NAs）可帮助患者减轻脑出血后继发性神经损伤，减轻神经功能障碍程度［5］。深入研究miRNAs在脑出血后继发性神经损伤发生过程中的调控机制有助于该病的早期诊断及治疗，早日改善临床神经功能缺损症状。文献报道显示，miRNAs在脑出血后继发性神经损伤发生过程中，具有维护血脑屏障完整性、减轻炎症、减少细胞凋亡及抗氧化应激等作用［2］。现就miRNAs的上述调控机制的研究进展综述如下。

1 保护血脑屏障

血脑屏障是血液和大脑之间的物理和生理屏障，可防止神经毒性血浆成分、血细胞及病原体进入大脑，是一种多细胞神经血管复合体。其完整性主要由脑内皮细胞（血脑屏障的基本单位）决定，脑内皮细胞之间紧密连接的改变和这些细胞的胞吞作用对血脑屏障的完整性有显著影响［6］。此外，内皮细胞和形成神经血管单元的支持细胞（如星形胶质细胞、免疫细胞、血管周细胞和大脑中的其他细胞）之间的相互作用也有助于维持血脑屏障的完整性［7］。miRNAs通过多种途径参与调节血脑屏障，但大多数miRNAs通过靶向脑内皮细胞、内皮连接分子，直接或间接影响血脑屏障的紧密连接，参与血脑屏障完整性的改变［8］。miRNAs作为表观基因修饰的重要组成部分，在脑出血后因血脑屏障损伤继而导致神经损伤的发生过程中起重要的调控作用。

1.1 miR-126-3p miR-126-3p是一种与血管完整性、血管生成和血管炎症有关的微小RNA，miR-126-3p在脑出血患者受损脑组织中表达水平较低且向血液中的释放含量明显减少［9-10］。miR-126-3p能够通过下调出血区域血管细胞黏附因子-1，增加内皮细胞中血管内皮生长因子A的水平和降低Cas‑pase-3的水平，减轻颅内出血诱导的血脑屏障破坏［9］。miRNAs在维持血管生理结构的完整性和内皮细胞的正常屏障功能方面起重要作用。通过调节血脑屏障结构的渗透性，减少有害物质向血液中的释放水平，减轻颅内出血对血脑屏障的破坏，减少发生神经损伤概率［11］。

1.2 miR-27a-3p miR-27a-3p是一种与内皮细胞高度相关的miRNAs，在内皮细胞中高度表达，属于脑出血患者血清中下调miRNA之一，同时在脑出血大鼠模型的血肿周围、血肿块和血清中均显着下降；具有保护血脑屏障，减轻神经损伤的潜在功能［10，12］。在动物实验中，miR-27a-3p可通过靶向内皮水通道蛋白11保护血脑屏障；同时可减少与血肿相邻的垂死神经元的数量，降低血肿周围组织的凋亡率，防止脑出血后血脑屏障破坏，进而减轻继发性神经损伤［13］。

2 抑制炎症反应

炎症是一种复杂的损伤后免疫反应，尤其是神经炎症更成为影响脑出血预后的关键因素。在正常情况下，炎症有助于清除坏死细胞或组织，并启动组织修复过程；然而，过度激活免疫反应会对机体造成严重损害。小胶质细胞被认为是脑出血后最先做出反应的炎性免疫细胞，激活的小胶质细胞，可以动态和暂时改变其表型，从而分化成两种表型，M1（释放促炎因子，加重炎性反应，如IL-1β、TNF-α等）和M2（帮助机体吞噬血肿，其释放的抗炎因子，对抗炎症反应，如IL-10、TGF-β等）；与此同时，脑出血会触发炎症因子及生物活性因子的释放，如IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α等，并通过细胞形态及生理变化继而造成脑出血后的炎症反应的发生与发展，损伤神经功能［14］。miRNA能够靶向参与调控炎症反应及小胶质细胞极化，在脑出血后具有抗炎作用，减轻神经损伤。

2.1 miR-223 miR-223是miRNA家族的重要成员之一，于2003年由定量聚合酶链反应首次鉴定［15］。它的基因位于人类、老鼠和牛的X染色体上。miR-223可以结合特定的靶基因来抑制各类细胞（如粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）中的促炎细胞因子或炎症信号，调节促炎或抗炎巨噬细胞极化，促进中枢神经系统髓鞘再生［16］。miR-223已被证明是脑出血后小胶质细胞激活，炎症和神经元损伤的重要调节剂［17］。在脑出血 动物模型中，miR-223通过IL-1β与caspase-1，促进NLRP3下调，进而调控炎症反应，减轻脑水肿及神经功能缺损症状［18］。

2.2 miR-21 miR-21参与脂多糖诱导的巨噬细胞促炎特性，其过表达可有效促进促炎细胞因子上调，将细胞推向促炎表型，在炎性免疫反应到其消退的转变中发挥重要作用［19-21］。在脑出血动物模型中，miR-21可以调节Akt和（或）ERK/MAPK通路，及负调节Toll样4受体的表达来减轻炎症反应［22-23］。此外，miR-21的过表达可以减轻NF-κB途径的激活（NF-κB［24］是一种转录因子，能够诱导促炎基因的的表达，调节先天免疫细胞和炎性T细胞的存活、活化和分化，介导炎性反应，是与炎症有关的中心通路），通过外泌体从间充质干细胞运到神经元，促进间充质干细胞的成活率，有效降低了间充质干细胞的凋亡率和凋亡相关蛋白表达，减轻神经损伤［25］。

2.3 miR-146a miR-146a是位于5号染色体长臂上的miR-146家族成员，对中枢神经系统疾病中起关键作用，在脑出血患者血清中表达水平较低。miR-146a的过表达能够降低脑出血后炎症介质（如IL-1β、IL-6、IL-8）和生物活性因子的释放，能够负向调节脑出血后诱导的小胶质细胞炎性反应并减少脑出血后的细胞死亡，具有预防脑损伤及继发性神经损伤的作用［26］。YUAN等［27］研究证明，miR-146a可通过靶向白介素1受体相关激酶1和TNF受体相关因子6（TRAF6）的3'UTR，抑制NF-κB通路，降低脑出血大鼠促炎性细胞因子（MMP-9，TNF-α和IL-1β）的产生，可有效预防炎性细胞浸润造成的神经损伤。

2.4 miR-155 miR-155由位于21号染色体上的B细胞整合基因编码，广泛存在于中枢神经系统，是一种关键的促炎miRNA，在炎性疾病中具有重要作用［28］。同时，在中枢系统疾病中，敲除miR-155能够提高神经元的内在生长能力、促进轴突生长和可塑性［29］。在脑出血大鼠模型急性发作期，大鼠顶叶皮层部miR-155表达水平及IL-1β、IL-6和TNF-α含量均升高；经侧脑室注入miR-155抑制剂后，IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子水平均降低，改良的神经严重程度评分也随之降低，表明miR-155信号参与脑出血后继发性神经损伤过程，阻断miR-155通路能够通过减少促炎因子释放，降低神经功能损伤程度，进而改善大鼠脑出血后神经功能缺损症状［30］。

3 减少细胞凋亡

细胞凋亡是一种以能量依赖和程序性细胞死亡为特征的细胞死亡，被认为是导致脑出血后细胞损伤的主要机制。它通过清除老化或受损细胞维持止血机制，并且通过去除有缺陷的和过度的细胞调节免疫系统［31］。简而言之，细胞凋亡的过程，最初由内在或外在途径触发。内源性途径与线粒体信号传导途径相关；外源性途径是通过细胞表面死亡受体，包括肿瘤坏死因子TNF-α以及TNF相关的凋亡诱导配体受体活化进行的［32-33］。脑卒中后诱导大量Ca2+流入细胞，导致线粒体细胞色素c（Cytc）或凋亡诱导因子释放［34］。释放的Cytc与凋亡蛋白酶激活因子1和procaspase-9结合形成凋亡体，激活caspase-9及caspase-3，导致nDNA损伤并最终导致细胞死亡，损伤神经功能，继而出现如肢体偏瘫、麻木等一系列神经功能缺损症状。据报道，miRNA的表达可以通过调节靶基因的水平、旁分泌信号传导，介导血管生成和保护神经活性，调节脑卒中后神经元存活，预防神经损伤，发挥神经保护作用［35-37］。

3.1 miR-132 miR-132是中枢神经系统中含量最多的miRNA之一。通过其靶基因甲基CpG结合蛋白2和Rho GTPase激活剂p250GAP调节树突形态和突触功能，在神经发育和神经元活动的调节中起关键作用［38］。miR-132的过表达，能够显著下调脑组织中Bax、Cytc和caspase-9的表达，上调BCl-2的表达，并降低Caspase-3活性，抑制细胞凋亡［39］。在靶向蛋白方面，miR-132能够靶向SIRT1 3'UTR（一种组蛋白脱乙酰酶）并降低其活性，从而导致p53（一种凋亡诱导剂）乙酰化增加，最终导致Puma和Noxa等其他促凋亡基因的过度表达，最终导致细胞死亡［40］。现有研究表明，促进miR-132过表达能够减少脑出血小鼠细胞凋亡，减轻脑出血后继发性神经损伤，降低小鼠患神经功能障碍的概率［41］。

3.2 miR-181c miR-181c在中枢神经系统中皮质区域广泛表达［42］，其表达动态变化可能与特定的神经发育阶段有关，能够控制发育中的皮质神经元中神经突和树突棘的生长［43-44］。miR-181c通过直接靶向调节TNF-α，最终诱导细胞凋亡［45］。在脑出血大鼠模型中，miR-181c通过靶向PTENPI3K/Akt通路及Bcl-2/Bax比值直接介导和调节细胞凋亡，且其表达水平的高低与神经严重程度评分高度相关，表明miR-181c可通过调节神经细胞凋亡，在脑出血后发挥保护神经作用，减轻神经损伤［46］。

4 抗氧化应激

氧化应激主要由促氧化剂（ROS/RNS）的过度平衡和（或）细胞中抗氧化系统的缺乏引起。脑出血期间自由基和ROS的形成涉及多种机制，包括对N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体的高刺激、Ca2+超载、线粒体功能障碍和神经元一氧化氮合酶激活［31］。氧化损伤是脑出血后脑损伤进而导致神经损伤的基本机制。氧化应激状态时，相当于大脑所处环境具有高度氧化的特性、低水平的抗氧化剂含量和极高的铁含量，此时大脑的神经功能极易受损［47］。目前广泛研究出可维持大脑氧化还原稳态的几种抗氧化酶和解毒酶包括谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽S-转移酶。与此同时，Nrf2作为重要的氧化和异生物质应激反应的主转录因子，成为抗氧化反应的关键组成部分，减轻脑出血后继发性神经损伤，保护神经功能［48］。在miRNAs家族中，有85种miRNA可 以 调 节Nrf2 mRNA的 水 平［49］。XU等［50］表 明，miR-27b可以直接靶向Nrf2 mRNA来调节Nrf2表达，抑制miR-27b能够减轻脑出血后脑损伤，并通过Nrf2/ARE通路上调脑出血后Nrf2、Hmox1、SOD1和Nqo1的表达，减轻神经损伤，避免发生神经功能缺损。该基因可能是治疗脑出血后继发性神经损伤的潜在治疗靶点。但截至目前miRNAs在脑出血后继发性神经损伤中的抗氧化作用的研究较少，应进一步探索miRNAs在脑出血后继发性神经损伤中抗氧化应激方面的作用。

综上所述，miRNAs通过参与脑出血的病理过程发挥作用，是调节脑出血后继发性神经损伤的重要环节，为干预脑出血后继发性神经损伤提供了多重靶点。虽然目前有关miRANs治疗脑出血后继发性神经损伤的研究仍处于初级阶段，且多数研究仅限于动物实验，临床研究仍处于较低水平；但基于miRNAs减轻脑出血后继发性神经损伤的作用机制及其多重作用，进一步探讨脑出血患者miRNAs的表达变化、探寻脑出血后继发性神经损伤的相关miRNAs分子靶点及其作用机制、以及如何安全有效地利用miRNAs防治脑出血后继发性神经损伤具有长远的临床意义。