重楼皂苷抗肿瘤及调节肿瘤免疫微环境研究进展

张小力，刘 芹，刘宝瑞，

(1.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院，江苏 南京 210008；2.南京大学医学院附属鼓楼医院，江苏 南京 210008)

肿瘤免疫在恶性肿瘤治疗中发挥了越来越重要的作用，很多传统的中药均具有抗肿瘤和免疫调节双重功能。重楼在我国药用历史悠久，其主要功能为清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊等[1]，近年来也因为抗肿瘤作用受到研究人员的重视。研究表明重楼提取物对多种肿瘤细胞的增殖具有良好的抑制效果,其主要的活性成分甾体皂苷可分为两类:薯蓣皂苷和偏诺皂苷，薯蓣皂苷又可以根据具体结构的不同分为重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷 Ⅱ、重楼皂苷Ⅲ和C22-甲氧基-原薯蓣皂苷等[2]。重楼皂苷的抗肿瘤作用可以表现在直接作用于肿瘤细胞，通过介导细胞凋亡或抑制增殖等机制干预肿瘤生长，例如重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ等具有细胞毒活性。另一方面，重楼皂苷也可能参与调节肿瘤微环境，对肿瘤造成间接的抑制、清除作用，重楼皂苷Ⅰ-Ⅲ等被证实具有免疫调节活性[3]。下面我们将对重楼皂苷对肿瘤细胞及肿瘤微环境的作用展开综述。

1 对肿瘤细胞的直接作用

“瘤”和“癌”字初在古代中医典籍中出现时一般指赘生物，东汉《说文解字》解释“瘤，肿也”，宋代《卫济宝书》提到：“癌疾初发，却无头绪，只是肉热痛，过一七或二七，忽然紫赤微肿，渐不疼痛，迤逦软热，紫赤色，只是不破……”，又有《仁斋直指方论》：“癌者，上高下深，岩穴之状……毒根深藏，方孔透里”。此外，噎嗝、积聚、失荣等由症状描述建立的病名也被认为可能是肿瘤的伴随症状及肿瘤恶液质的表现。可见中医对于肿瘤的诊治是以外科疮疡类疾病的形态分析为基础，内科杂病的病机辨证为主要思路，以清除毒邪和改善症状为主要治疗目的。

中医认为肿瘤是多种病理因素错综交杂的产物，表现为热毒与痰瘀搏结于脏腑经络，在局部形成积块，因此清热解毒成为主要的治疗方法之一。重楼性味苦寒，是清热解毒的代表性药物之一，《神农本草经》述其：“主惊痫，摇头弄舌，热气在腹中，癫疾，痈疮……”，明代《滇南本草》又提到“消诸疮，无名肿毒”的功用。《医宗金鉴》中有化疔内消散，将重楼配伍知母、贝母、天花粉、皂角刺、金银花等，用于治疗疔毒，《医方简义》加减千金牡丹皮饮选择重楼配伍牡丹皮、瓜蒌仁、金银花、薏苡仁，主治妊娠一切内痈，胃痈酌加川连5钱。重楼的抗肿瘤效果也被现代药理学证实，张欣等[4]选择不同产地的重楼提取有效成分，发现不同来源的重楼总皂苷均有较好的抑制SW620、HT-29细胞生长活性，其直接抗肿瘤作用的机制主要包括细胞凋亡和周期阻滞。

1.1 内质网应激途径诱导肿瘤细胞凋亡 内质网(Endoplasmic reticulum，ER)是真核细胞中的细胞器，具有调节细胞内脂质生物合成和蛋白质折叠和转运的功能。环境中出现Ca2+水平改变、营养状态、病原体或炎症刺激等均可导致ER中的蛋白质错误折叠和错误折叠蛋白质积累，有研究发现肿瘤细胞在缺氧等恶劣环境下可以上调内质网腔内分子伴侣的表达，促进蛋白的折叠并加速内质网修复[5]，从而适应恶劣环境并快速生长。张嘉玲等[6]发现重楼皂苷Ⅶ可抑制卵巢癌细胞在小鼠体内增殖，促凋亡基因以及内质网相关基因GRP78和CHOP表达均显著增加，证明重楼皂苷诱导肿瘤细胞凋亡，并提示凋亡机制可能和内质网应激途径相关。半胱天冬酶12(Caspase-12)被证明只与内质网应激相关凋亡有关[7]，阳丹丹等[8]检测重楼皂苷处理后的肝癌HepG2细胞中IRE-1通路相关蛋白水平，发现重楼皂苷Ⅰ处理后细胞裂解半胱天冬酶12(Cleaved-Caspase-12)水平显著升高，Caspase-12显著下降且降低趋势与Cleaved-Caspase-12升高保持一致，IRE-1水平显著升高，提示重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡过程中存在内质网应激，进一步研究发现IRE1通路下游的关键蛋白质XBP1水平显著降低，但是促凋亡蛋白质CHOP的水平无明显变化，加入内质网稳定剂4-PBA后观测到HepG2细胞凋亡率进一步增加，因而重楼皂苷诱导的细胞凋亡作用不是单纯由内质网应激引起的。

以上研究均证实了重楼皂苷诱导肿瘤细胞凋亡与内质网途径相关，但具体机制仍然存在争议，实验结果的差异一方面可能与细胞种类、选取的皂苷种类相关，另一方面，内质网应激过程较复杂，仍有较多机制尚未探明，未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)不仅是肿瘤细胞对环境的适应机制，也有研究发现UPR活化可抑制细胞周期蛋白D1的翻译导致细胞周期阻滞[9],在癌症发展的初始阶段甚至可参与阻止原癌基因诱导的恶性进展[10]。

1.2 线粒体途径诱导细胞凋亡 Jacobson等[11]证明线粒体在细胞凋亡中起作用后，越来越多的实验结果表明线粒体途径是介导细胞程序性死亡的重要方式。细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)是呼吸链中的重要载体，分布在线粒体内膜上且无法通过外膜，线粒体内的Cyt-C出现缺失或功能障碍会导致线粒体呼吸链功能异常，使ATP水平无法维持从而导致细胞坏死，Cyt-C释放到胞质中还可激活Caspase途径诱导细胞凋亡[12]。Bcl-2家族位于线粒体外膜上，包含促进和抑制细胞凋亡两种类型的蛋白质。各种细胞毒性刺激，包括致癌应激和化学治疗剂等抑制抗凋亡蛋白，促进促凋亡蛋白例如BAX和BAK，形成能渗透线粒体外膜的寡聚体，细胞凋亡因子由此进入胞浆导致细胞凋亡[13]。

陈舒怡等[14]发现重楼皂苷Ⅰ处理过的NCI-H661细胞线粒体快速碎裂，表明重楼的抗肿瘤作用或与线粒体途径相关，Zeng等[15]用重楼皂苷I处理HepG2细胞，24 h后活细胞百分率明显降低，细胞质中的Cyt-C水平显著升高，而线粒体中的Cyt-C水平降低，认为重楼皂苷I改变了线粒体膜通透性，引起细胞线粒体功能障碍诱发凋亡。Zhou等[16]用重楼皂苷Ⅶ处理抑制HT-29和HCT-116细胞，均检测到抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降及促凋亡蛋白BAX水平升高，提示重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ诱导细胞凋亡的机制可能与影响Bcl-2蛋白家族蛋白的表达有关。

1.3 对肿瘤细胞周期的阻滞 肿瘤细胞的细胞质中存在胞质微管，微管在细胞分裂前期解聚形成微管蛋白，后续可进一步聚合成为纺锤体，帮助细胞完成有丝分裂，因此临床上常用秋水仙碱类和长春碱类药物干扰纺锤体合成达到抗肿瘤作用[17]。于思等[18]在重楼皂苷Ⅰ处理的HCT116细胞中也观察到微管结构变化，影响了纺锤体的形成，最终细胞周期停滞于G2/M期。除了破坏微管，Zhang等[19]发现重楼皂苷Ⅰ以浓度依赖的方式上调p21的表达，使前列腺癌PC3和DU145细胞出现G0/G1阻滞，这种对p21的调节被认为FOXO3信号通路有关，研究证明FOXO3基因敲除可部分缓解重楼皂苷I诱导的膀胱癌细胞G2/M期阻滞[20]。

上述研究提示了重楼皂苷在联合化疗中的应用潜力，重楼皂苷拥有秋水仙碱类化疗药物破坏有丝分裂的功能并可以通过影响p21表达发挥细胞周期阻滞作用，与其他抗肿瘤药物联用时还存在较好的增敏效果，但是重楼皂苷对纺锤体形成的干扰作用和对p21相关通路的影响均缺少更多种肿瘤细胞系的观察结果。

2 肿瘤免疫-微环境

癌毒理论是由毒邪理论发展出的创新概念，癌毒指内外因素诱导下人体脏腑功能失调、气血郁滞而产生的特异性致病因子，这一理论强调了肿瘤形成过程漫长，又因毒致虚纠缠脏腑从而进一步生长、复发、转移的动态过程[21]。既往实验及报道中，重楼在自身免疫系统疾病当中存在较好的疗效[22]，其免疫调节活性值得进一步探究。李春江[23]发现重楼皂苷可以使荷瘤小鼠胸腺指数显著增加，证明重楼皂苷对胸腺组织起到显著的保护作用，增加机体的抗肿瘤免疫能力，由此提示重楼皂苷作为抗肿瘤药物，除直接作用于肿瘤细胞诱导凋亡外，可能存在免疫调节的间接抗肿瘤作用。

2.1 免疫细胞 肿瘤微环境中包含多种免疫细胞，包括巨噬细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞等，免疫细胞的低反应能力是肿瘤的一大显著特征[24]，包括增殖数量、杀伤活性、分泌功能等多个方面，因此增强免疫细胞功能也成为了中药对免疫调节的研究重点。在肿瘤的细胞免疫治疗中，重楼皂苷也被证实具有协同促进作用，细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer，CIK)是一种由多种细胞因子在体外刺激后获得的异质细胞，是非特异性细胞疗法的重要组成。实验发现重楼皂苷联合CIK细胞组的肿瘤抑制率高于单纯使用重楼醇提物或CIK细胞治疗[25]，因此，重楼皂苷与过继性免疫治疗可能有较好的协同作用。

2.2 细胞因子 肿瘤免疫微环境中非特异性免疫因子包括白细胞介素(Interleukin，IL)、趋化因子、干扰素(Interferon，INF)及肿瘤坏死因子等，肿瘤细胞上部分细胞因子和趋化因子呈现出过表达。其中，主要由Th1细胞分泌的IL-2，IFN-γ等，主要介导细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，由Th2细胞分泌的IL-4,IL-5,IL-6和IL-10等与体液免疫有关，抑制T细胞抗肿瘤免疫，促进了肿瘤细胞免疫逃逸[26]。柴红妍[27]的体内实验验证促炎性细胞因子CL-16、CL-17和趋化因子CXCL16及其受体参与调控肺癌侵袭转移过程，发现重楼皂苷粗提取物对相关受体有显著抑制作用。滕文静等[28]的体外实验观察到重楼总皂苷对结直肠癌发生发展的抑制，实验验证其机制与下调 IL-6的分泌，抑制IL-6/STAT3信号通路有关。体内及体外实验结果均展现出重楼皂苷对肿瘤微环境中细胞因子的作用有显著的调节，对控制肿瘤的局部进展和远处转移有抑制作用。

2.3 肿瘤血管 持续的血管生成是恶性肿瘤的特征之一，肿瘤细胞分泌促血管生成因子刺激内皮细胞增殖，后续通过调节血管内皮细胞迁移，进一步形成新的血管系统为肿瘤供能，满足其进一步生长以及排出代谢废物和二氧化碳的需要。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是常见的促血管生成因子，由肿瘤细胞、周细胞(包裹在血管内皮周围的一种特殊间充质细胞)分泌[24]。胡静等[29]发现对肝癌H22荷瘤小鼠用重楼醇提物灌胃治疗后，肿瘤组织微血管密度显著下降。柴红妍[27]的肺腺癌小鼠模型中发现重楼皂苷能够有效抑制STAT3核转录因子mRNA的水平，显著降低VEGF-A和血管间细胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表达，通过抗血管生成抑制肿瘤转移。邓碧凡等[30]用重楼皂苷Ⅰ干预低氧喉癌Hep-2细胞后，观察到HIF-1α、VEGF表达的降低。

新生血管促进了肿瘤的生长转移，也干扰了抗肿瘤免疫的建立，目前的抗血管生成治疗策略很少实现完全的反应，KEYNOTE-426、IMBRAAVE 150等临床试验证明了抗VEGF药物联合PD-1/PD-L1抑制联合应用的有效性[31]，目前针对更多肿瘤类型、更多种抗VEGF药物靶点的尝试正在进行。重楼皂苷具有较好的抗血管生成作用，抑制VEGF的表达可能是其发挥免疫调节作用的机制，但具体靶点有待进一步研究，重楼皂苷与抗PD-1抗体是否存在协同抗肿瘤作用也值得进一步探索验证。

2.4 细胞外基质 细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的降解是肿瘤侵袭转移的关键环节。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMP)是一类锌离子和钙离子依赖的蛋白酶，可靶向并降解ECM中多种蛋白。吕芸等[32]发现重楼皂苷D可抑制A549细胞的迁移和侵袭，观察到MMP-2和MMP-9的表达水平呈浓度依赖性降低，提示重楼皂苷D可能通过抑制MMP对ECM的降解起到间接抗肿瘤作用。李宇华等[33]在重楼皂苷Ⅵ处理过的LoVo细胞实验中也观察到MMP-2和MMP-9的表达下调，证实重楼皂苷在LoVo细胞侵袭转移过程中的调控作用。

重楼皂苷通过下调MMP的表达抑制ECM降解，从而延缓肿瘤的局部侵袭，也在一定程度上逆转肿瘤局部免疫抑制微环境，理性推测重楼皂苷可能与目前在临床已取得一定疗效的免疫治疗策略如免疫卡控点抑制剂、过继性细胞治疗、治疗性疫苗等具有协调作用，是良好的免疫治疗增敏剂，值得进一步在临床前和临床试验研究中探索和证实。

3 小 结

重楼具有一定的抗肿瘤作用，体内及体外实验中对很多肿瘤细胞系均有效，适合临床应用于恶性肿瘤的治疗，且不良反应少。重楼皂苷是其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分，目前对重楼皂苷抗肿瘤机制的研究大多集中在对多种肿瘤细胞线粒体凋亡途径的验证，对于其他机制尤其是具体靶点的研究较少，抗肿瘤作用机制有待进一步实验挖掘。近年来围绕着诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞等角度进行的中药抗肿瘤作用机制研究得到广泛关注，中药单体成分展现出与已知化疗药物类似的细胞杀伤能力，但临床应用方面存在较多障碍，且不能达到完全替代化疗药物的效果。部分细胞毒性化疗药物可以通过诱导免疫原性肿瘤细胞死亡或参与免疫效应机制来提高抗肿瘤免疫应答[34]，重楼皂苷也具有相似的细胞毒性和对微环境的修饰能力，中药直接应用于抗肿瘤免疫治疗的可行性有待进一步探索。

“顾护正气”的思想贯穿整个中医抗肿瘤治疗过程，中药与免疫治疗相结合拥有良好的临床应用潜力。黄芪根中分离出的黄芪多糖无法对抗肿瘤细胞的直接细胞毒性，但是可以降低肿瘤表面PD-L1表达来刺激宿主免疫从而增强化疗药物疗效[35]，雷秦等[36]发现苦参碱可以加强NK细胞对HL60细胞的杀伤效率，Mo等发现去甲斑蝥素(中药斑蝥抗癌主要成分斑蝥素经水解去二甲基后的产物)可以减少疫苗治疗中肿瘤组织的Tregs(Regulatory T cells)浸润从而促进抗肿瘤疫苗的疗效[37]。《生草药性备要》中提到重楼“补血行气，壮精益肾，能消百毒”，《本草求原》也有“益脾汁，升胃之清气”的论述，都提示重楼皂苷的抗肿瘤应用与免疫治疗具有广泛的结合空间。积极构建联合治疗策略，有助于促进基于中药创新药物的研发和拓宽传统中药的临床应用方式。