核酸适配体在病原微生物检测中的应用研究进展

王佳齐，吴倩倩，郑晓雪，李倩

1 潍坊医学院医学检验学院，山东潍坊261053；2 潍坊医学院附属医院

核酸适配体是一种分子量较小的生物分子，通常为20～100 bp 的寡核苷酸分子，能够依靠自身的三维结构与相应的同源配体相结合［1］。ELLING⁃TON 和 SZOSTAK 首次提出了适配体的概念［2］。同年，TUERK 和GOLD 也建立了指数富集配体系统进化（SELEX）技术，用来筛选核酸结合蛋白的高亲和力和高特异性适配体，进而开展快速简便的结合位点研究［3］。核酸适配体可以通过其独特的三维结构高选择性地与目标靶点结合，具有与抗原-抗体反应相类似的高亲和性、高特异性。同时，核酸适配体还具有分子量小、无免疫原性、合成成本低、可通过化学修饰获得高稳定性等区别于蛋白质抗体的优点，成为目前病原微生物检测的研究开发热点。现将核酸适配体在病原微生物检测中的应用研究进展综述如下。

1 核酸适配体的制备及修饰

1.1 核酸适配体的分子结构 核酸适配体的典型三维结构基序包括茎环、富含嘌呤的凸起和发夹、发夹结构、假节、口袋及G-四分体结构等。核酸适配体可以通过适应性地改变自身构象和三维结构折叠状态来结合各种各样的靶分子［4］。核酸适配体识别靶分子的过程类似于抗原—抗体的构象识别，结构复合物的形成方式亦相似，该过程主要通过范德华力、氢键、静电作用、平面结构堆叠及形状互补来达到高特异性和高亲和性的结合。结合过程的解离常数（Kd）非常小，范围在pM 到nM 之间，因此，核酸适配体常被叫做“化学抗体”［5］。

1.2 核酸适配体的制备 SELEX 技术是研发特定核酸适配体的“金标准”。SELEX 技术首先制备一个与给定配体具有高特异性和亲和性的随机序列文库，然后将该文库中具有高亲和性的小分子进行多轮高亲和性筛选和指数富集，随即通过RT-PCR 和PCR 进行扩增［5］。核酸适配体的制备通常包含以下几个步骤［6］：①构建随机寡核苷酸文库。通过化学方法合成的单链DNA 或RNA 文库一般包含1014～1018个20～70 bp 长度的单链寡聚核苷酸，在这些序列的两端为特定引物的结合位点，而内部则为随机序列。两端的固定序列可进行后续筛选过程的扩增。②随机文库与靶分子孵育。初始文库中的随机序列会叠成不同的二级和三级结构，然后与固定或游离的靶分子在最佳条件下形成的核酸适配体-靶分子复合物。③除去未结合的寡核苷酸片段。通过膜过滤、亲和柱、磁珠、毛细管电泳等多种不同的方法将与靶分子不具有亲和性或亲和性低的寡核苷酸片段与复合物分离。④扩增结合的核酸适配体。与靶分子结合的适配体序列使用PCR（DNA 适配体）或RT-PCR（RNA 适配体）方法进行扩增。扩增产物将作为下一轮筛选的适配体子文库，一般进行8～20 轮筛选，即可得到高亲合力和高特异性的核酸适配体。⑤将最终获得的适配体进行克隆和鉴定。

1.3 核酸适配体的修饰 由于核酸适配体是一类小分子物质，且对核酸酶敏感性高，因此可以通过化学修饰核酸适配体戊糖骨架或侧链基团掺入非天然核苷酸，或在核酸适配体末端进行加帽处理，来提高其功能稳定性［7］。化学修饰有助于在核酸适配体的筛选过程中体现最佳的药代动力学特性，还有助于提高核酸适配体的亲和力，增加文库的多样性，从而提高SELEX技术的成功率。大多数核酸酶水解核酸时极化核糖的2′-OH基团，攻击磷酸二酯键，导致核酸序列的水解。将2′-OH基团化学置换为不同的基团（如2′-氟，2′-氨基或2′-甲氧基），或将磷酸二酯键进行硼垸化磷酸盐修饰和硫代磷酸修饰，或两种修饰方法同时使用，均可改进适配体的稳定性。此外，核酸适配体与较大的生物纳米材料结合，增加复合物的总分子量，可以有效增强对核酸酶抗性和靶分子亲和力，如聚乙二醇、金纳米粒子、脂质体等［8］。

2 核酸适配体在病原微生物检测中的应用

病原微生物所导致的感染性疾病曾随着抗感染药物的问世而得到有效的控制，但随着耐药性的发展，病原微生物可以通过不同的耐药机制使药物无法实现治疗效果，导致大部分感染性疾病难以治愈［9］。大部分抗感染治疗依靠经验用药，导致药物选择失误、病情延误、治疗成本上升等问题接踵而至［10］。因此，快速灵敏、低成本的病原微生物检测方法成为目前的研究热点。常见的检测方法大多基于抗原抗体反应，但抗体制作过程复杂、易变。相比之下，核酸适配体的优势更为明显，更适合病原微生物检测。

2.1 核酸适配体在寄生虫检测中的应用 目前，原生动物寄生虫仍影响着全世界数百万人，迫切需要新的检测技术与药物治疗靶点。最近，已有不少报道将核酸适配体作为寄生虫诊断和靶向控制的工具，并讨论其在临床应用中的可行性。CHEUNG等［11］使用靶向恶性疟原虫乳酸脱氢酶的DNA 适配体和适配体系留酶捕获分析方法对两种疟原虫进行了物种特异性的鉴定，并在临床样本中进行了测试，结果表明，核酸适配体检测对恶性疟原虫血样是特异的，并且可以区分间日疟原虫血样，有望成为一种新的特异性疟疾诊断策略。IQBAL 等［12］利用DNA适配体耦合磁珠的方法，同时使用一种灵敏而特异的电化学传感器作为第二配体与链霉亲和素包覆的磁珠结合，以监测和鉴定隐孢子虫的卵囊，此方法快速简便、技术要求低。OSPINA-VILLA 等［13］利用分子生物学和计算机工具对溶组织阿米巴中的多聚腺苷酸化所必需的mRNA 裂解因子EhCFIm25 进行了鉴定，同时采用SELEX 筛选了针对EhCFIm25 的单链RNA 适配体，RNA-蛋白质的结合分析证实，适配体可在体外与EhCFIm25 相结合，并可抑制溶组织阿米巴寄生虫增殖，导致细胞迅速死亡，证实了RNA 适配体在控制溶组织阿米巴感染方面的潜在价值。

2.2 核酸适配体在细菌检测中的应用 目前检测细菌的核酸适配体主要针对全细胞，其次包括细胞裂解液和单一蛋白。近年来，通过SELEX 方法，已获得了多种高特异性的结合细菌的核酸适配体，如结合Escherichia coliO157：H7外膜脂多糖、Salmonel⁃la entericaser. Typhimurium、Vibrio fischeriATCC 49387 霍 乱 毒 素 B 亚 基 、Streptococcus pneumoniaeATCC 49619、Staphylococcus aureus的ssDNA适配体，以及针对Mycobacterium tuberculosisH37Rv HspX、FbpA、MPT64 的 DNA 适配体等［14-21］。单一蛋白靶位适配体虽然结合力强，但是由于筛选使用的是体外纯化蛋白，在细菌表面的分布、构象较体外有很大不同，因此这种核酸适配体与细胞的结合力不稳定，且体外表达纯化蛋白程序复杂，不一定能获得可溶性功能蛋白。某一种微生物的全细胞或细胞裂解液靶位复杂，核酸适配体特异性不强，加入另一种微生物进行反向筛选，可以显著提高核酸适配体的特异性。另外，SELEX 筛选后的优化措施，如鉴定靶分子-适配体复合物结构，分析结合反应的机理、特异性和敏感性等，对核酸适配体检测的开发亦有重要意义。

2.3 核酸适配体在病毒检测中的应用 病毒感染可引起许多危及生命的疾病，如艾滋病、非典、肝炎、癌症等。由于病毒体外培养困难，临床检测多采用免疫学检测方法。然而，病毒所含蛋白质数量少、复杂程度低，更符合核酸适配体筛选检查的要求。相比其他病原微生物而言，病毒个体较小，核酸适配体亦可用于其治疗。目前，已有处于研发或临床应用阶段的病毒核酸适配体。PANG 等［22］通过SELEX 技术筛选出特异性结合人类免疫缺陷病毒（HIV）稳定蛋白质（如整合酶）的shRNA 适配体，可抑制HIV 在细胞培养物中的复制。PLESHAKOVA 等［23］获得了针对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性结合HCVcoreAg的ssDNA 适配体，已被成功地用作在复杂蛋白质基质（如人血清）存在条件下进行HCVcoreAg 检测的探针分子。BAI 等［24］获得了针对灭活完整的H1N1病毒颗粒的DNA 适配体，拥有更好的病毒变异适应性。HMILA 等［25］通过 SELEX 技术筛选出对 H7N9具有高结合亲和力的适配体，并使用该适配体作为配体，开发了高度灵敏的实时免疫聚合酶链反应（RT-I-PCR）检测方法。

2.4 核酸适配体在真菌检测中的应用 致病性真菌侵入人体组织器官，导致炎症反应及组织损伤，尤其是侵袭性真菌病，对人类健康形成了极大的威胁。BACHTIAR 等［26］采用 SELEX 技术筛选出了针对白假丝酵母ATCC 10231 细胞的RNA 适配体。通过测试所得适配体的结合力和白假丝酵母生物膜的代谢活性，证明了核酸适配体的亲和性与抗体的亲和性相当，并可抑制生物膜和菌丝的形成，具备应用于临床检测和治疗的潜力。JOO 等［27］建立了一个基于核酸适配体的快速检测黄曲霉素B1的分析方法，将适配体与荧光素相连，并利用了氧化石墨烯的荧光淬灭性，该方法比传统方法的检测范围更广，检测速度更快，更适合现场检测。ASWANI 等［28］更是将DNA 适配体与抗体结合起来，制备二者的杂交探针进行黄曲霉素B1的检测，具有明显的反应性和选择性，可应用于常规食品检测实验室中。

3 核酸适配体在病原微生物检测中的应用优势和问题

在临床上，蛋白质抗体被大量用于临床病原微生物的快速检测方法中，但抗体的应用受到其高免疫原性和高生产成本的限制。而核酸适配体凭借其分子量小、无免疫原性、高稳定性等特点成为了抗体的卓越替代品、补充品［29］。并且，核酸适配体由核苷酸组成，通过固相化学法大量合成生产，进行生产批准时可被当作是化学制品而非生物制剂，研发生产效率大大提升。抗体的生产主要依赖于体内合成，而且抗体结构复杂、配体类型单一，而核酸适配体是通过体外合成途径获得，底物类型广泛，结构简单，更适合于大规模工业化生产［30］。核酸适配体可通过化学修饰从而获得良好的热稳定性和化学稳定性。化学修饰的核酸适配体可在多种缓冲液中保存较长时间，亦可在常温下进行运输。现已成功针对不同类型的靶标设计出相对应的核酸适配体，这些靶标包括无机离子、药物、寡肽、蛋白质以及复杂的细胞或组织等，极大地扩展了核酸适配体的应用范围［31］。理论上SELEX 可用于筛选针对各种类型靶标的高亲和力核酸适配体，但实际成功率较低，导致基于核酸适配体的成熟产品较少地应用于临床。影响核酸适配体开发与应用的主要障碍包括：①核酸的构象多样性比蛋白质抗体更有限；②带有高负电荷的核酸适配体难以与带负电荷的目标分子结合；③体外产生的核酸适配体具有不同的生物可利用性和体内应用的结合特性；④SELEX 过程耗时且成功率低。因此，在核酸适配体的应用可行性方面还有许多问题亟待解决。

综上所述，核酸适配体依赖其独特的三维结构和制备技术，在寄生虫、细菌、病毒、真菌等检测领域具有高稳定性、高特异性、低成本的优势。目前，感染性疾病的检测和诊断方法具有较高的市场需求。在医源性和食源性病原微生物检测方面，核酸适配体展露出更广阔的应用前景，相关检测手段能够进一步消除诊断的不确定性，从而减少广谱抗菌药物的经验使用，规避了产生耐药性的风险。下一步，如何快速获得具有优异可利用性的核酸适配体、缩短筛选周期、提高SELEX 技术成功率、节省开发时间和成本投资将成为研究热点，进一步促进核酸适配体技术在病原微生物检测方面的应用。