沉默Pard3 基因对宫颈癌细胞系SiHa 迁移、侵袭的影响及其机制

2021-01-10 10:19刘迎嘉阿仙姑哈斯木
山东医药 2021年9期
关键词:极性细胞系上皮

刘迎嘉,阿仙姑·哈斯木

1 新疆医科大学第五附属医院,新疆乌鲁木齐830011;2 新疆医科大学

研究[1]显示,宫颈癌晚期复发患者预后差,与肿瘤细胞的侵袭和转移关系密切。分离缺陷基因3(Pard3)的产物是一种分布在正常细胞的极性蛋白,它的改变和缺失都会造成肿瘤细胞的侵袭、转移[2]。研究[3]发现,JAKs/STAT3 信号转导通路的激活具有调节免疫系统、促进细胞生长和细胞周期、抗凋亡等作用,并与肿瘤的发生发展密切相关。目前关于Pard3 和JAK2/STAT3 在宫颈癌侵袭转移中的作用机制尚不清楚。2017 年 6 月 1 日—2020 年 6 月 30日,本研究观察了沉默Pard3 基因对宫颈癌细胞系SiHa迁移、侵袭的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞分组及Pard3 小干扰RNA 转染 将人宫颈癌细胞系SiHa 细胞培养于10% 胎牛血清的DMEM 中,37 ℃、5%CO2饱和湿度下培养,当细胞密度达到80%时用PBS 清洗、0.25%的胰蛋白酶消化后,加入完全培养基,按 1∶3 的比例传代,37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下扩大培养。针对Pard3 转录本(GAAGGTCTATGTCTACTGA 和GAAACAGCGTT⁃GGATGATA)设计小干扰RNA(siRNA)1 和siRNA2序 列 ,分 别 为 GGATAACAGTCGTGTTGAA、GAAGGTCTATGTCTACTGA,并构建Pard3基因沉默腺病毒表达载体。将SiHa 细胞分为siRNA1 组、siR⁃NA2 组、siRNC 组,siRNA1 组转染 siRNA1,siRNA2组转染siRNA2,siRNC 组转染空白载体,转染后在37 ℃、5%CO2培养箱中继续孵育48 h。

1.2 三组细胞迁移和侵袭能力观察 采用Tran⁃swell 迁移和侵袭试验。①Transwell 迁移实验:取处理好的SiHa 细胞PBS 清洗,0.25%胰酶消化收集,1 000 r/min 离心 5 min,去上清,PBS 润洗两次,清洗掉残余血清,加入无血清DMEM 培养基稀释细胞浓度至2.5×105/mL,备用。DMEM 培养基中加入Tran⁃swell 小室,分别接入 200 μL 各组细胞悬液,37 ℃5%CO2培养箱中培养。取出Transwell 小室,PBS 清洗,70%冰乙醇溶液固定细胞1 h,用干净的棉球将上室一侧的未迁移细胞擦干净,200 倍显微镜下观察拍照,计算细胞迁移相对数量。各组细胞迁移相对数量=各组迁移细胞数/siRNC 组迁移细胞数×100%。②侵袭实验:取处理好的SiHa 细胞PBS 清洗,0.25%胰酶消化收集,1000 r/min 离心5 min,去上清,PBS 润洗两次,清洗掉残余血清,加入无血清DMEM 培养基稀释细胞浓度至2.5×105/mL,备用。DMEM 培养基中加入Transwell 小室后,于上室底部中央垂直加入100 μL终浓度为1 mg/mL的Matrigel,待Matrigel 干成胶状后在Transwell 上室分别接入200 μL 各组细胞悬液,37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。取出Transwell小室,PBS清洗,70%冰乙醇溶液固定细胞1 h,用干净的棉球将上室一侧的未侵袭细胞擦干净,200 倍显微镜下观察拍照,计算细胞侵袭相对数量。各组细胞侵袭相对数量=各组侵袭细胞数/siRNC组侵袭细胞数×100%。

1.3 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 检测 采用实时定量PCR(qRTPCR)法。取各组细胞,使用TRIzol 试剂提取总RNA,Prime-Script 反转录成 cDNA。以 cDNA 为模板,以GAPDH 为内参基因,进行PCR 反应。引物序列如下:Pard3 上游引物为 5′-CAGGTGCATCGCTT⁃GGAAC-3′,下游引物为 5′-GCTGAGACATTGTTG⁃GTGCC-3′;JAK2 上 游 引 物 为 5′-GTCATG⁃GCCCAATTTCGATGG-3′,下游引物为5′-TCGCTC⁃GACAGCAAAAGTCA-3′;STAT3 上 游 引 物 为 5′-AGAAAACATGGCTGGCAAGG-3′,下游引物为 5′-GCCTCCTTCTTTGCTGCTTT-3′;E-cadherin 上游引物为 5′-CGTAGCAGTGACGAATGTGG-3′,下游引物为 5′-CTGGGCAGTGTAGGATGTGA-3′;Vimentin上游引物为5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′,下游引物为5′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-3′。反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40 个 循 环 。 以 2-ΔΔCt表 示 细 胞 中 目 的mRNA的相对表达量

1.4 三组细胞中Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白检测 采用 West⁃ern blotting 法。取各组细胞,用Cell Mitochondria Isolation Kit 试剂盒分离线粒体和细胞浆蛋白,使用DG-3022A 酶标仪测定OD568值,根据标准蛋白浓度和相应的OD 值计算直线回归方程得出样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清沸水浴变性后和MARKER加入上样孔进行电泳分离,取出凝胶根据MARKER切下目的条带转膜。用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭液浸泡PVDF 膜进行封闭,4 ℃条件下过夜,加入兔单克隆抗体,用PBS-Tween 20洗涤印迹3次,洗涤后HRP 二抗显影、冲洗胶片,用BandScan 分析胶片灰度值,以灰度值表示目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法 采用GraphPad Prism 5 统计软件。计量资料以-x ± s表示,比较用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组细胞迁移和侵袭能力比较 ①siRNA1组、siRNA2 组、siRNC 组细胞迁移相对数量分别为122.3±4.3、129.2±7.1、100.0±7.1,其中siRNA1组、siRNA2 组迁移相对数量与 siRNC 组相比,P均<0.05。②siRNA1 组、siRNA2 组、siRNC 组细胞侵袭相对数量分别为120.5 ± 5.8、131.3 ± 7.9、100.0 ±9.0,其中 siRNA1 组、siRNA2 组侵袭相对数量与siRNC组相比,P均<0.05。

2.2 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA 相对表达量比较 siRNA1 组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin mRNA相对表达量分别为0.7±0.2、1.2±0.3、1.1±0.1、0.7 ± 0.1、1.9 ± 0.3,siRNA2 组分别为 0.4 ± 0.1、1.0± 0.3、1.1± 0.2、0.5± 0.1、2.4± 0.3,siRNC组分别为 1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1、1.0 ± 0.2、1.0 ± 0.1,其中 siRNA1 组、siRNA2 组 Pard3、E-cad⁃herin、Vimentin mRNA 相对表达量与 siRNC 组相比,P均<0.05。

2.3 三组细胞中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量比较siRNA1 组中 Pard3、JAK2、STAT3、E-cadherin、Vi⁃mentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相对表达量分别为70.8 ± 1.5、101.9 ± 1.4、103.4 ± 7.0、74.6 ± 1.2、152.6 ± 7.4、174.7 ± 11.7、169.0 ± 6.0,siRNA2 组分别为49.6±1.0、102.1±0.9、100.0±6.3、62.6±2.1、182.9 ± 4.4、220.4 ± 5.8、191.7 ± 9.7,siRNC组分别为 100.0 ± 3.6、100.0 ± 3.3、100.0 ± 2.7、100.0 ± 3.1、100.0 ± 1.4、100.0 ± 5.5、100.0 ±3.2,其中 siRNA1 组、siRNA2 组 Pard3、E-cadherin、Vimentin、p-JAK2、p-STAT3 蛋 白 相 对 表 达 量 与siRNC组相比,P均<0.05。

3 讨论

肿瘤进展的第一步是肿瘤细胞脱离环境获得运动性和侵袭性,与上皮-间质转化(EMT)的特征相对应[4]。在EMT 进程中,上皮细胞失去细胞间连接和顶端极性,获得间质和迁移特性,发生细胞形态和遗传标记的改变,包括上皮标记(如E-cadherin)的消失和获得间充质标记(如a-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白)[5-6]。研究[7]显示,细胞间相互连接作用减弱、失去细胞间黏连并改变细胞极性,往往是导致肿瘤细胞侵袭迁移的关键原因,而上皮细胞极性主要是依靠极性蛋白来调控的。

正常上皮细胞沿内部尖端基底轴呈现蛋白质的不对称分布,呈现极性状态,这种极性状态是由极性蛋白介导的。目前已知的极性蛋白有PAR 家族,包括 aPKC、Pard3 和Pard6 构成的极性复合物。研究[8]发现,在食管癌、乳腺癌、肺癌等细胞中,极性和上皮组织的丧失与恶性肿瘤和肿瘤进展密切相关。通过对siRNAPard3 食管鳞状细胞癌109 细胞系的研究[8]发现,Pard3 过表达降低了109 细胞的基础增殖率,抑制了DNA 复制,抑制了肿瘤细胞增殖和细胞凋亡,而沉默Pard3 则促进肿瘤细胞增殖和凋亡;与对照组相比,Pard3 过表达显著降低约50%的细胞侵袭能力,而沉默Pard3则显著促进109细胞的侵袭能力。乳腺癌细胞株MDA-MB-231 和SK-BR3 中过表达GAB1 增强了与Pard3 的相互作用,导致了Pard3与非典型PKC 极性蛋白复合物的解离,促进了乳腺癌细胞的侵袭、迁移。有报道在人肺腺癌组织中Pard6b 和PKC 的表达低于癌旁正常肺组织,实验小鼠腺癌组织中Pard3 和PKC 水平亦降低;此外发现Pard3 基因体中的甲基化位点与Pard3 的表达呈正相关,Pard3基因的甲基化增加了细胞对卡铂的敏感性,对Pard3的抑制增加了肺癌细胞的化疗耐药性。

本研究利用沉默Pard3 基因载体转染SiHa 细胞,与对照组siRNC相比,实验组siRNA1、siRNA2转染48 h 后Pard3mRNA 和蛋白相对表达量呈明显现下降趋势,其中siRNA2 组下降更为显著,说明基于Pard3 转录本的两条小干扰RNA 序列设计成功,同时Pard3基因沉默腺病毒载体转染SiHa 细胞的基因转染实验亦成功。体外siRNA 成功沉默Pard3 基因后,通过对Transwell 小室的基底膜进行侵袭、迁移后附着的细胞数量明显增加,说明沉默Pard3 后Si⁃Ha 细胞迁移、侵袭能力增强。ZHANG 等[9]研究发现,抑制miR-483可增加Pard3的表达,抑制miR-483可降低TGF-271 诱导的细胞迁移和侵袭能力,Pard3的下调导致了间变性甲状腺癌细胞的侵袭,提示Pard3 过表达可减弱肿瘤细胞侵袭、迁移能力,而Pard3低表达或沉默则增强细胞侵袭、迁移。

JAKs/STAT3 是恶性肿瘤增殖、进展和凋亡的经典途径。LI 等[10]通过建立 3p22.2 抑癌基因与STAT3形成蛋白复合物,阻断STAT3与JAK2相互作用和 STAT3 磷酸化,IL-6 的刺激增强了 DLEC1 与STAT3 的结合,使STAT3 与JAK2 的相互作用减弱,进而导致STAT3 磷酸化水平降低,最终导致淋巴结转移、肿瘤复发和转移。WANG 等[11]体外研究发现,抑制LINC00518 表达可显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。LINC00518的下调抑制了JAK/STAT3 的激活,进而降低了N-cad⁃herin 和 Vimentin 的表达。研究[12]发现,多种肿瘤中不同抑癌基因可以通过调控JAK/STAT3 通路的活性来抑制肿瘤的发生。有学者[13]首次报道宫颈鳞癌细胞中过表达抑癌蛋白M 受体(OSMR)、抑癌蛋白(OSM)及STAT3持续激活而调控细胞自主前馈信号通路。与抑癌蛋白M 受体过表达相关的恶变前效应主要是由JAK-STAT3 激活介导的,此通路受外源性OSM 和自分泌OSM-OSMR 相互作用所调控。通过中和抗体特异性抑制OSM-OSMR 相互作用,显著抑制STAT3 激活和前馈信号,导致侵袭、血管生成和迁移减少,提示STAT3被激活、STAT3信号通路被抑制可能是宫颈癌干预治疗的有效靶点。本研究发现,与转染后的siRNC组相比,siRNA1组、siRNA2组的JAK2、STAT3 的mRNA 和蛋白的相对表达量均无显著差异,而磷酸化的JAK2 和STAT3 蛋白表达增加,siRNA2 组升高显著,说明沉默Pard3 基因上调JAK2/STAT3 磷酸化信号转导通路,发挥生物调节功能,促进了肿瘤细胞的侵袭、迁移。

E-cadherin 是一种分布在细胞表面和细胞间连接处的细胞黏附分子,表达缺失可导致细胞连接的破坏,肿瘤组织中E-cadherin 表达缺失提示肿瘤细胞浸润转移的可能性较高。Vimentin 主要分布在间叶组织中,因此,E-cadherin 和Vimentin 常被作为肿瘤细胞发生上皮间质转化即EMT 的遗传标记。LI等[14]在体外肝细胞性肝癌细胞系中通过靶向E-cad⁃herin、N-cadherin、Vimentin 和 Twist 相 关 蛋 白 1(Twist),探讨了肿瘤抑制因子UPF1 表达水平对EMT 过程的影响,结果显示,UPF1 过表达时,N-cad⁃herin、Vimentin 和 Twist 表达水平明显上调,E-cad⁃herin 表达下调,蛋白阵列分析则报道了相反的结果。ZHOU 等[15]用免疫组化染色检测 10 例良性和42 例口腔鳞癌肿瘤组织E-cadherin 和Vimentin 的表达,E-cadherin 在正常口腔黏膜上皮中阳性表达,而波形蛋白在正常口腔黏膜上皮中未见表达;42 人中有26 人(61.9%)和16 人(38.1%)表达E-cadherin 和Vimentin,E-cadherin、Vimentin 表达与淋巴结转移、肿瘤分期有显著相关性。本研究发现,siRNA1组和siRNA2组中E-cadherin mRNA 和蛋白相对表达量显著降低,siRNA2组降低更显著;siRNA1组和siRNA2组VimentinmRNA 和蛋白相对表达量均显著升高,其中siRNA2 组显著升高,提示Pard3 沉默后,SiHa细胞的上皮特征减弱、间质特征增强,导致明显的上皮间质转化加速EMT进程。

综上所述,沉默Pard3 通过上调JAK2/STAT3 信号通路磷酸化,促进SiHa 细胞迁移和侵袭并发生明显的EMT,从而促进肿瘤进展。

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