血清sLAG3、miR-221水平对帕金森病的诊断效能

杨东锋，李传侠，王义义

1 天津市宁河区医院，天津301500；2 天津市海河医院

帕金森病（PD）是常见的神经退行性疾病，目前尚缺乏有效治疗手段，大多数患者会随着疾病的不断进展丧失生活自理能为，给患者家庭和社会带来精神和经济上的双重负担［1］。由于PD 发展至一定程度后较难控制，因此如何在疾病早期对疾病进行有效的诊断和治疗已成为临床研究重点［2］。可溶性淋巴细胞活化基因3（sLAG3）是淋巴细胞活化基因3（LAG3）的裂解产物。LAG3 可经跨膜金属蛋白酶介导裂解为sLAG3，sLAG3可在血液中稳定表达，且其表达水平可较好的反映组织细胞中LAG3 的表达水平。近年来有研究［3］显示，LAG3 可调控 PD 发病中的重要因子α-突触核蛋白（α-Syn）的表达，可能在PD的发生发展中起到重要的作用。微小RNA（miR⁃NA）是一类内源性的小分子单链RNA，具有较丰富的生物学功能，如调控细胞的分裂、参与免疫炎症的调节等，目前已发现多种miRNA 与PD 的发生、发展密切相关，如 miR-7［4］、miR-133b［5］等。研究［6］显示，miR-221 在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中异常表达。本研究观察了血清sLAG3、miR-221 水平对PD患者的诊断效能，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年12月天津市宁河区医院收治的PD 患者92 例，记为PD 组。纳入标准：①PD 诊断标准参考《中国帕金森病的诊断标准（2016 版）》中的相关内容［7］；②临床资料完整；③未同时参与其他研究；④患者或其家属对本次研究知情同意。排除标准：①合并有其他类型的脑部疾病，有明确的脑外伤史；②合并有恶性肿瘤者；③合并有严重的心、肝、肾等重要脏器功能障碍者；④合并有自身免疫性疾病者；⑤合并有严重感染者。另选取同期体检健康志愿者50例作为对照组。PD 组92 例患者中，男58 例、女 34 例，年龄（61.23 ±10.26）岁，病程（3.67± 3.01）年，合并高血压27例，合并糖尿病23 例，文化程度初中及以下40 例、高中38 例、大专及以上 14 例。对照组男 30 例、女 20 例，年龄（60.89±9.52）岁，合并高血压11例，合并糖尿病10 例，文化程度初中及以下21 例、高中19 例、大专及以上10 例。PD 组和对照组的性别、年龄、文化程度、合并高血压和合并糖尿病等一般资料比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。所有PD 患者均采用帕金森病评定量表（UPDRS）评估病情的严重程度［8］，包括精神行为、情感障碍、日常生活、运动能力、治疗的并发症5 个部分。本研究主要选用其中的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分，其中UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分分别代表了患者的精神活动和情感障碍、日常生活能力及运动功能，各项目均分为5 个等级，计分为0～4 分，分数越高表示症状越重。同时，依据Hoehn-Yahr 分级将患者进行分组。Hoehn-Yahr 分级是根据患者的病情严重程度将其分成 0 期、1 期、1.5 期、2 期、2.5 期、3 期、4 期、5 期这8 个分期，分期越高代表病情越严重。92 例PD 患者中，1～2 期 38 例，纳入到轻度组，2.5～3 期 30 例，纳入到中度组，4～5 期 24 例，纳入到重度组［9］。本研究经天津市宁河区医院伦理委员会同意并批准。

1.2 两组研究对象血清sLAG3 检测 采用酶联免疫吸附法。收集所有研究对象的空腹静脉血5 mL，采用离心机以3 000 r/min 的转速离心10 min，移取上清液至EP 管，采用酶联免疫吸附法检测血清sLAG3 水平。Elisa 试剂盒购自英国Abcam 公司，Elx800 酶标仪购自美国Biotek 公司，相关检测均严格遵循对应试剂盒的操作指南进行。

1.3 两组研究对象血清miR-221 检测 采用实时荧光定量PCR 法。取离心后的血清，采用mir Vana RNA Isolation Kit 提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA 的浓度和纯度，采用逆转录试剂盒逆转录提取cDNA，利用7900HT 实时荧光定量PCR 系统，以U6作为内参基因进行PCR 反应。PCR 反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 个循环。引物序列如下：miR-221 上游引物为5′-GGACCACCGCT⁃CATCGCTAA-3′，下游引物为5′-GTTACTATATGC⁃CAAGCCCTAG-3′。U6 上游引物为 5′-CGCTTCG⁃GCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 为 5′-TTCAC⁃GAATTTGCGTGTCAT-3′。以 2-ΔΔCt表示血清中 miR-221的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。相关性分析采用Pear⁃son 相关分析法。采用受试者工作特征曲线（ROC）评价血清sLAG3、miR-221 水平对PD 的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组研究对象血清sLAG3 水平、miR-221 相对表达量比较 PD 组血清sLAG3 水平、miR-221 相对表达量分别为（932.54 ± 173.18）pg/mL、31.63 ±6.42，对照组分别为（705.96 ± 113.58）pg/mL、23.98± 4.89，两组相比，P均＜0.001。

2.2 不同病情严重程度的PD 患者血清sLAG3 水平、miR-221 相对表达量比较 重度组血清sLAG3水平、miR-221 相对表达量分别为（1 048.88 ±126.87）pg/mL、37.08 ± 4.51，中 度 组 分 别 为（926.87 ± 163.52）pg/mL、32.03 ± 6.84，轻度组分别为（863.54 ± 142.67）pg/mL、27.87 ± 4.36，组间相比，P均＜0.05。

2.3 PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221 相对表达量与UPDRS 评分的相关性 PD 患者UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分分别为（4.91 ±1.58）分、（20.15 ± 8.36）分、（34.81 ± 12.54）分。相关性分析结果显示，PD 患者血清sLAG3 水平与UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分均呈正相关（r分别为0.384、0.426、0.453，P均＜0.05），血清miR-221相对表达量与UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分均呈正相关（r分别为0.421、0.378、0.352，P均＜0.05）。

2.4 血清sLAG3、miR-221 水平对PD 的诊断效能血清sLAG3 水平诊断PD 的曲线下面积为0.828（95%CI为0.762～0.894），取截断值为887.62 pg/mL时，血清sLAG3水平诊断PD的敏感度为55.43%、特异度为94.00%。血清miR-221 水平诊断PD 的曲线下面积为 0.801（95%CI为 0.728～0.874），取截断值为27.22 时，血清miR-221 水平诊断PD 的敏感度为71.74%、特异度为72.00%。取血清sLAG3 水平截断值为887.62 pg/mL、miR-221 水平截断值为27.22 时，血清 sLAG3 联合 miR-221 水平诊断 PD 的敏感度为80.43%、特异度为76.00%。

3 讨论

PD 又称震颤麻痹，静止性震颤是PD 患者常见的首发症状，除此之外，患者还常常出现运动迟缓、肌强直、姿势步态障碍、嗅觉障碍等临床症状，严重影响患者的运动功能和日常生活，使得患者的生活质量明显降低［10］。PD 多发于中老年人，且其发病率会随着年龄的增加而增加，近年来随着我国老年化社会的到来，PD 患者的数量呈明显上升的趋势［11］。患者的临床症状是诊断PD 的重要依据，但PD 起病隐匿，通常需要在患者多巴胺能神经元和（或）纹状体内多巴胺水平明显减少时才会出现明显的临床症状，因此在疾病早期进行诊断存在一定的困难，临床在诊断PD时易出现误诊、漏诊的现象［12］。生物标志物是传统方法诊断疾病的重要补充，其在疾病中通常呈异常表达，可通过临床检验其表达水平来分析患病的可能性，且与临床症状、评分量表等具有一定主观因素的诊断手段相比，生物标志物更加客观，可减少主观因素的干扰，近年来在辅助临床诊断疾病上起到了重要作用。

LAG3 是一种编码与CD4 同源的跨膜糖蛋白，LAG3 基因位于人染色体12p13.32 上，分布于活化的 T 淋巴细胞、NK 细胞、B 细胞、树突样细胞膜表面，具有调节机体免疫功能和炎症反应的作用［13］。LAG3 可经跨膜金属蛋白酶介导裂解为sLAG3，sLAG3 可在血液中稳定表达，且其表达水平可较好的反映组织细胞中LAG3 的表达水平。本研究结果显示，PD 患者的血清sLAG3 水平明显高于健康人群，且其表达水平与病程严重程度密切相关，提示sLAG3在PD患者血清中呈异常高表达，可能参与了疾病的发生发展。GUO 等［14］的研究表明，LAG3 的基因多态性与中国女性人群的PD 发病风险有关。α-Syn 是PD 发生发展过程中的关键因子，其可促进线粒体功能障碍和氧化应激反应，并能导致神经元损伤和特定的多巴胺能神经细胞死亡，α-Syn 在细胞间朊病毒样传播行为是PD 病理扩散的关键环节［15］。研究［3］显示，LAG3是α-Syn的转运受体，多巴胺神经元细胞膜表达的LAG3 可以和α-Syn 特异性结合，触发内吞作用进入神经元胞体，导致细胞凋亡，而在抑制LAG3 的表达后以上作用则明显减少，提示LAG3 可能通过调控α-Syn 的传播参与PD 的进展。

miR-221是miR-221/222家族的一员，基因位于X 染色体的 p11.3 区［16］。近年来的研究［17］发现，miR-221 与多种神经系统疾病密切相关，如阿尔茨海默病、胶质瘤等。miR-221 作为miRNA 的一种亚型，其可在血液中稳定表达，便于临床检测，符合作为辅助临床诊断生物标志物的基本条件。本研究结果显示，PD 患者的血清miR-221 水平明显高于健康人群，且其表达水平与病情严重程度密切相关。周梅等［18］研究亦显示，miR-221 在 PD 患者血清中呈异常高表达，与本研究结果一致。有细胞实验［19］证实，HOX 转录反义RNA 主要是通过促进miR-221 的表达来诱导神经细胞凋亡。神经退行性疾病患者特定部位有明显的铁沉积，当铁含量增多时则会出现脂类过氧化反应、自由基生成、线粒体功能异常等情况，促进 PD 的发生发展［20］。有相关研究［21］显示，miR-211 可调节PD 模型中转铁蛋白受体2 的表达，影响铁元素的积累，进而在PD等神经退行性病变疾病的发生发展中起到一定的作用。

本研究通过初步分析发现，sLAG3、miR-221 均在PD患者血清中呈异常表达，且表达水平与病情密切相关，二者均有作为诊断PD 生物标志物的潜力。进一步的 ROC 分析发现，血清 sLAG3、miR-221 对PD 的诊断价值较高，sLAG3 和 miR-221 的曲线下面积分别为0.828、0.801。然而单一指标诊断通常具有一定的局限性，如sLAG3 诊断PD 的特异性虽然很高，但敏感度较低，发现真阳性的能力较弱，因此本研究进一步分析了sLAG3、miR-221 联合诊断的价值，结果显示，联合诊断可进一步提高对PD 的诊断价值，敏感度和特异度均较单一指标诊断时明显提高。

综上所述，PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221相对表达量均升高，与病情严重程度呈正相关关系。检测血清sLAG3、miR-221有助于PD的诊断。