全局转录调控在细胞工厂构建中的应用与进展

周子康，许平

（1 上海交通大学生命科学技术学院，上海200240；2 上海交通大学微生物代谢国家重点实验室，上海200240）

许多原核和真核细胞系统是生产高附加值化合物、天然产物和生物能源的最佳宿主。经典的代谢工程方法非常适合于改善通路通量和提高产品产量。但是，这种方法在改变复杂细胞表型的能力上非常有限。复杂表型包括生长速率、生物转化率和耐受性，而全局转录调控工程（global transcription machinery engineering,gTME）是改变复杂细胞表型的通用方法。这种方法主要是引入通用转录相关蛋白的突变，引发基因网络和细胞代谢的重编程。通过将突变蛋白表达与表型选择和筛选联系起来，从而筛选出引发新的复杂细胞表型的突变体。但是，由于很难从头预测突变蛋白序列与功能之间的联系，因此通常通过创建转录因子的突变文库并选择可改善所需表型的突变库来简化该方法。gTME 已成功应用于原核和真核系统，提高了微生物的环境耐受性、代谢产物的产量和底物的利用率，包括乙醇耐受性[1-2]、番茄红素产量的提升[2]和木糖发酵过程的优化[3]。因此，gTME 是基于转录水平菌株开发的有效工具，可以单独使用或与其他代谢工程技术结合使用，构建更高效的细胞工厂。

1 全局转录调控及其原理

细胞生长过程中有着严格的调控机制，可通过对转录元件的精准调控，实现细胞中各个基因的时序性转录。细胞代谢途径的复杂性决定了基因与表型之间并非简单的线性对应关系。某些特定的表型通常由多个基因控制。传统的代谢工程方法主要针对单一基因进行修饰，但由于代谢途径的高度复杂性，导致代谢工程的表型往往不能符合预期要求[4-5]。因而，只有同时对多个控制基因同时进行修饰才能得到目标表型。人们对转录水平和细胞表型之间关系的深入认识，使得直接操控转录组获得目的表型成为可能，通过细胞转录水平的调控，改进细胞的某些代谢性能[1-2,6-8]。

全局转录调控工程利用易错PCR、定点突变等技术对细胞中的转录因子或其他转录元件进行定向或非定向的突变修饰，调节RNA 聚合酶对启动子的结合能力，改变细胞转录效率，使得基因的表达在转录水平发生整体改变。整体转录水平的变化可以引发多基因控制的细胞表型，通过不断筛选可以实现复杂表型的定向进化。此外，基因上游调控区域也能影响细胞的转录水平。这些调控区域可与特定蛋白结合，实现下游转录的“激活”或“抑制”，形成“+”或“-”的调控途径，由不同的调控途径联结成复杂的调控网络，共同控制细胞内的各种代谢过程。Martínez-Antonio[9]和Richard等[10]分别研究了大肠杆菌和酿酒酵母中的转录调控网络，证实原核和真核细胞的功能与转录调控网络高度相关，多层次的转录调控网络和全局转录因子调控着其他转录元件，实现细胞内部转录过程的精准调控。转录组水平的多样性赋予了细胞不同的表型[3,11-13]。相比紫外诱变、定点突变等方法，全局转录调控效率更高，可以引发代谢途径上多个基因转录的同时微调，实现对复杂代谢途径的快速优化，从而高效获得目的表型。

2 全局转录调控在代谢工程中的应用

2.1 gTME在原核生物中的应用

gTME 可以同时上调或下调数百个基因，尤其是那些涉及DNA 识别的成分，如全局转录因子和RNA 聚合酶亚基。 将来自耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）的全局调控因子IrrE 引入大肠杆菌，以增强其对乙醇、丁醇和乙酸盐胁迫的抗性[14]。同样，来自密苏里游动放线菌（Actinoplanes missouriensis）、 橙 黄 小 单 孢 藻（Micromonospora aurantiaca） 和 沙 里 氏 单 胞 菌（Salinispora arenicola）的外源西格玛因子σHrdB，被引入游动放线菌中，用于随机诱变/DNA 改组，成功地提高了游动放线菌中替考拉宁（太古霉素）的产量。据报道，最佳突变菌株可产生5.3mg/mL 替考拉宁，产量是原始菌株的2 倍[15]；Alper 等[2]发现gTME 在番茄红素的生物合成过程中效果显著。他们从4 种大肠杆菌中分离出各自的σ70因子，对各自编码σ70因子的rpoD 进行多轮随机突变，再将突变后的rpoD 分别回补，测定含有突变σ70因子的菌株中番茄红素的产量。其中一株突变菌株中的番茄红素含量达到了7.7mg/L，比野生型大肠杆菌的4.2mg/L 的番茄红素含量提高了将近一倍。于慧敏等[16]利用gTME 的方法，以大肠杆菌为宿主，通过对大肠杆菌细胞的RNA 聚合酶中编码σ 因子的rpoD和rpoS进行随机突变，建立突变文库，通过高通量方法筛选高产透明质酸的突变株。其中突变rpoD 筛选获得的菌株D72 透明质酸的产量达到561.4mg/L，透明质酸的细胞干重达到了265mg/g。

2.2 gTME在真核生物中的应用

相比原核细胞中的唯一的四亚基组分RNA 聚合酶，真核生物有三种RNA 聚合酶，聚合酶Ⅰ存在于核仁，聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ存在于核质。聚合酶I 合成除5S 以外的rRNA，聚合酶Ⅱ主要是RNA聚合酶，聚合酶Ⅲ合成tRNA 和5S rRNA。另外，真核生物转录需大量转录因子，它们按顺序结合到聚合酶上共同完成转录[17]。正是这种复杂性，为gTME 技术在真核细胞中的应用提供更多的突变靶标。Alper 等[1]通过易错PCR 对酿酒酵母RNA 聚合酶Ⅱ转录因子TFIID 中TAF25 亚基和与TATA 序列结合的SPTl5亚基进行多轮突变，筛选出对高浓度葡萄糖和乙醇耐受的酵母菌株；Cao 等[18]在酿酒酵母中引入TPS1（6-磷酸-海藻糖合酶）可以使酿酒酵母在18%（体积分数）乙醇中的存活率更高，最终乙醇生产浓度提高约15%；Jung 等[19]通过抑制ATH1（酸性海藻糖酶）的表达促进了酵母在8%（体积分数）乙醇条件下的生长，并使乙醇生产率提高了约100%。Qiu等[20]利用易错PCR对酿酒酵母的RNAP Ⅱ的Rpb7 亚基进行突变，筛选乙醇高耐受性和高产突变株，结果发现，突变株的乙醇产量约为122g/L（理论产率的96.58%），比对照组增加了40%。同时，DNA 微阵列分析表明，发酵12h后，突变株中有369个基因存在表达差异，涉及糖酵解、酒精发酵、氧化应激反应等。由此可见，全局转录工程着眼于直接调控细胞整体基因转录水平，指向性强，方法简便。对所得到的突变体进行分子机制的解析可为进一步定向改造提供关键的研究目标。

3 全局转录调控提升菌株耐受性

随着gTME 方法的发展，已有许多通过gTME技术提高菌株耐受性的报道。Alper等[2]在大肠杆菌中通过筛选突变的全局转录调控因子σ70，不仅提高了番茄红素的产量，同时使得突变株能够双重耐受60g/L乙醇和高浓度的SDS；Klein-Marcuschamer等[21]应用gTME 技术对植物乳杆菌的σ 因子进行改造，发现仅将σ因子中345位的Gln替换成Lys就可以显著提高植物乳杆菌对乳酸和高浓度盐的双重耐受性；Gao等[22]随机突变大肠杆菌σD因子，从突变文库中筛选出的耐酸突变体在pH 3.17 条件下生长速率是野生型的1.5 倍；Matsui 等[23]对酿酒酵母的转录调控因子PDR1进行单点突变，成功筛选出有机溶剂耐受的菌株。突变株能在异辛烷/YPD 两相系统中将3-氧代丁酸丁酯还原成3-羟基丁酸丁酯；Basak 等[24]将甲苯作为选择压力，利用易错PCR 将大肠杆菌的全局调控因子CRP 进行随机突变和建库筛选，在诱变文库中筛选到了一株能够耐受0.23%甲苯的突变体，而这个甲苯浓度下的野生型菌株的生长被完全抑制。进一步的研究表明，改造CRP可以明显改善大肠杆菌在氧化应激条件下的耐受性，通过高通量筛选得到了耐受突变株OM3，该菌株能够在12mmol/L H2O2条件下生长，而野生型的生长则被完全抑制。Zhou等[25]在大肠杆菌中表达全局转录调控因子IrrE显著促进了酸性条件下恶臭假单胞菌的生长和提高了尼古丁的降解效率。可以预见，gTME 在工业微生物的育种中将得到更广泛的应用。

4 结语

代谢工程学的出现旨在改善细胞特性，以生产有用的化学药品并用于更广泛的生产生活应用场景中。进一步的细胞改良和多基因表型的调控需要同时精准控制多个基因的表达。全局转录调控概念的出现，适时地扩展了代谢工程的应用范围。gTME可以通过修饰负责协调转录的关键转录因子介导整个转录组水平的调控，从而控制生物合成途径中关键酶的表达水平，最终确定代谢网络的方向、通量和平衡[26]。这种方法已经在细胞工程、代谢工程应用实例中取得了成功，使其目标化合物的产量、宿主细胞耐受性等有了显著的提高和改善。细胞全局转录调控工程的研究表明，细胞代谢网络具有很大的弹性，可通过多种手段对代谢通量进行优化，对代谢网络进行重编程，从而获得性能优良的工业微生物菌种。gTME 结合生物信息学相关技术，将使人们获得更多的基因与表型之间的关系信息，为更快速改造细胞的代谢和生理功能提供新的方向。