烟草青枯病发病土壤理化性状及细菌群落结构分析

樊俊 谭军 王瑞 邓建强 张继光 徐大兵 施河丽 向必坤

摘 要：为了解土壤理化性状及细菌群落结构与青枯病发生的关系，在湖北恩施典型烟区采集了160个植烟土壤（82个未发病土壤，78个发病土壤），检测了土壤理化指标，并采用16S rRNA基因测序技术分析了烟株发病与未发病根际土壤细菌群落结构的差异。结果表明：（1）与未发病土壤相比，发病土壤细菌群落结构多样性更高。（2）发病土壤劳尔氏菌属（Ralstonia solanacearum）相对丰度显著高于未发病土壤，而鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）相对丰度则相反。（3）青枯病的发生使土壤微生物网络结构更复杂而稳定性降低，并改变了部分核心点位细菌种类。（4）典范对应分析（CCA）表明，土壤pH和速效磷（AP）可能是影响烟草青枯病发生的重要土壤因子。综上所述，土壤pH、AP与细菌Sphingomonas、Arthrobacter、Pseudomonas相对丰度的增加和Ralstonia相对丰度的降低可能是减少烟田青枯病发病的关键因素。

关键词：土壤;烟草;青枯病;细菌;群落结构;网络分析

Abstract： In order to understand the relationship between soil physical and chemical properties， bacterial community structure and bacterial wilt， the physical and chemical indexes of 160 tobacco growing soils （82 rhizosphere soils of non-infected and 78 rhizosphere soils infected by bacterial wilt） were tested， and 16S rRNA gene sequencing technology was used to analyze the differences of bacterial community structure of the soils. The results showed that： （1） Compared with non-infected soils， the diversity of soil bacterial increased with the infection of tobacco bacterial wilt. （2） The relative abundance of Ralstonia was significantly improved in the rhizosphere soils infected by bacterial wilt， while Sphingomonas， Arthrobacter and Pseudomonas were of the opposite effects. （3） The complexity of microbial network structure was enhanced， while the stability decreased and the type of bacteria at the core point changed in rhizosphere soils with the infection of tobacco bacterial wilt. （4） CCA analysis indicated that soil pH and available phosphorus （AP） were the important factors affecting the occurrence of bacterial wilt. In conclusion， the increase of soil pH， AP and relative abundance of Sphingomonas， Arthrobacter， Pseudomonas and the decrease of Ralstonia might be the key factors to reduce the incidence of bacterial wilt in tobacco field.

Keywords： soil; tobacco; bacterial wilt; bacterial; community structure; network analysis

勞尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是一种土传细菌，具有广泛的寄主范围，可侵染50多科450余种植物[1]，其引起的烟草青枯病（Tobacco bacterial wilt）是危害我国烟草生产的主要病害之一。青枯劳尔氏菌通过根部伤口、根尖或次生根侵染烟株，最终定殖于木质部，继而产生大量的胞外多糖堵塞维管束组织，造成叶片萎蔫、发黄坏死，最终导致烟株死亡[2]。我国烟区青枯病发病率呈逐年升高趋势，据统计全国2015年青枯病发病面积达到8.67万hm2左右，造成了巨大的经济损失[3]。

近年来，随着16S rRNA基因测序等分子生物技术的快速发展，越来越多的学者开始关注青枯病害与土壤细菌之间的关系[4]。有研究表明，劳尔氏菌在侵染植株过程中，能够引起感病部位土壤微生物群落结构和多样性变化[5]，这可能是影响烟草根茎部病害发生的关键因子之一[6-7]。土壤中的微生物之间也存在着各种相互作用，如寄生、共生、拮抗等。有许多学者运用模拟生态网络构建的方法来探究微生物间的相互关系[8-9]，这不仅有利于了解原位状况下土壤微生物间的相互作用，也为维持土壤健康提供了理论支撑[10]。而采集大数量样本，分析土壤养分、物理结构及根际细菌群落多样性在青枯病发病与未发病土壤之间差异的研究却鲜有报道。因此，本文采用16S rRNA基因测序技术，对青枯病发病与未发病烟株根际土壤的细菌群落结构、多样性、网络特性进行系统性分析，并探讨影响青枯病发生的主要土壤理化指标和细菌种类，以期为当地烟草青枯病的防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集与制备

取样地点在湖北省恩施州青枯病发病的区域，包括恩施市盛家坝乡，宣恩县晓关乡、椒园镇，咸丰县朝阳寺镇、坪坝营镇、唐崖镇、黄金洞乡、忠堡乡，鹤峰县燕子乡和中营乡。土壤类型均为黄棕壤。在2019年9—10月烟叶采收结束后，选取相临的青枯病发病区域和未发病区域，拔出烟株茎秆及根系，采用抖动法进行根际土壤样品采集，去除杂物，一部分土样过1 mm筛，装入5 mL的小试管中，标记好迅速放入冰盒，带回实验室放入液氮中，进行16S rRNA测序分析;另一部分土壤装入透气棉质袋，带回实验室风干，过20目和100目筛，测定常规化学指标。同时选择烟株中间垄体完整的区域开展环刀取样，测定土壤物理指标。烟株发病与未发病按照YC/T 39—1996的标准进行确定。共采集青枯病未发病土壤样品82个，用H表示;发病土壤样品78个，用UH表示。

1.2 土壤理化性状测定项目与方法

用pH计（赛多利斯PB-10）测定土壤pH;用重铬酸钾容量法测定有机质含量;用硫酸钼锑抗比色法测定有效磷含量（UV-1500型紫外可见分光光度计）;用火焰光度法测定速效钾含量（FP6400火焰光度计）;用凯氏定氮法测定土壤总氮含量[11]。土壤容重、含水量、总孔隙度、毛管持水量、通气孔隙度采用环刀烘干法测定[12]。

1.3 土壤微生物的检测

利用Fast DNA® Spin Kit（Qbiogene，Inc.USA）试剂盒提取土壤总DNA，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA的V3～V4可变区进行PCR扩增;PCR扩增体系为：土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5 μL，Forward引物和Reverse引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环;72 ℃延伸5 min。扩增后用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物品质，再经纯化、质检后建立测序文库，采用 Illumina Miseq PE250 平台由北京诺禾致源科技股份有限公司测序。采用Uparse软件对所有相应的Effective Tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类为OTUs。对OTUs代表的序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA数据库进行细菌物种注释分析，获得各分类水平上的群落组成[13]。

1.4 数据分析

采用Excel 2007、SPSS 22.0软件和https：//magic. novogene.com/平台进行数据分析和制图。

2 结 果

2.1 多样性分析

由图1可知，青枯病发病土壤的Shannon-Wiener、Simpson、Chao1和Ace指數高于未发病土壤，Shannon-Wiener和Simpson指数增加达极显著水平，说明烟草青枯病的发病提高了根际土壤微生物数量、群落结构的多样性。

2.2 属水平相对丰度分析

OTUs丰度前50的细菌属水平差异见图2，其中鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、Chujaibacter和节杆菌属（Arthrobacter）是烟草根际土壤中的优势菌属。Sphingomonas、Arthrobacter、马赛菌属（Massilla）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）和unidentified_Acidobacteria在青枯病未发病土壤中相对丰度较高，而Chujaibacter、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、unidentified_Gammaproteobacteria、unidentified_Gemmatimonadaceae、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、Bryobacter、酸杆菌属（Acidibacter）则在发病土壤中相对丰度较高，表明烟草青枯病发病明显改变了根际土壤中属水平细菌的组成。

对根际土壤中青枯病相关功能菌属（图3）的分析表明，发病土壤中，劳尔氏菌属（Ralstonia）相对丰度为0.292%，较未发病土壤增加了0.117%，达显著水平;而具有拮抗青枯病功能的假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Streptomyces）的相对丰度为0.228%和0.427%，较未发病土壤降低了0.356%和0.006%，其中Pseudomonas相对丰度降低达极显著水平，说明减少土壤中的Ralstonia和提高Pseudomonas相对丰度具有抑制青枯病发生的效果。

2.3 属水平网络分析

选取相对丰度前100的属水平细菌，采用spearman相关性分析法，r>0.6的保留，构建生态网络拓扑结构，过滤后采用Cytoscape软件进行网络作图（图4），比较烟草青枯病发病与未发病根际土壤细菌网络结构上的差异，研究它们之间的网络互作关系（表1）。青枯病发病土壤的细菌网络节点数、网络直径和平均路径距离低于未发病土壤，而连接数、平均连接度和图密度则相反。说明烟草感染青枯病后，根际土壤微生物网络结构更加复杂，各微生物间紧密程度更高。比较两种土壤微生物网络的核心点位细菌，发病土壤核心细菌属主要为Sphingosinicella、戴氏菌属（Dyella）、酸杆菌门属（unidentified_Acidobacteria）等，而未发病土壤核心细菌属主要为Sphingosinicella、溶杆菌属（Lysobacter）、酸杆菌门属（unidentified_ Acidobacteria）等，表明烟株感染青枯病，改变了根际土壤微生物网络中的部分核心细菌种类。

2.4 土壤因子分析

由表2可知，青枯病發病土壤的pH、速效磷（AP）、有机质（SOC）、总氮（TN）、容重（SBD）、毛管孔隙度（SCM）、毛管持水量（SCC）低于未发病土壤，其中pH、AP、SCM降低达显著水平（p<0.05）;而速效钾（AK）、含水量（SAWC）、总孔隙度（STP）、通气孔隙度（SAP）高于未发病土壤，其中SAWC、SAP增加达显著水平（p<0.05）。选择6个差异较大的土壤理化指标（pH、AP、AK、SCC、SBD、SCM），并结合OTUs数据矩阵来构建典范对应分析（CCA）模型（图5）。两个排序轴总共解释了66.41%的细菌群落变化，发病土壤主要分布在纵坐标的左侧，未发病土壤主要分布在纵坐标的右侧。其中pH、SCM、SBD与CCA1轴夹角较小，有较高的负相关性（−0.879、−0.691、−0.616），而SCC、AP和AK与CCA2轴夹角较小，有较高的正相关性（0.996、0.986、0.901）。根据图中箭头长度可以看出，与微生物群落结构有较大影响的土壤因子主要为pH，其次为AP，主要表现为对未发病根际土壤细菌的影响。

3 讨 论

烟草青枯病是一种危害极大的细菌性病害，其发生与根际土壤微生物的数量、群落结构等关系密切[14-15]。有学者认为土壤微生物群落结构越丰富、多样性越高，对抗病原菌的综合能力越强[16-17]。施河丽等[13]、陈乾锦等[18]研究表明健康烟株根际土壤细菌群落结构多样性高于发病烟株。本文中青枯病未发病根际土壤细菌群落结构多样性和复杂性低于发病土壤，与上述研究结论不一致。可能本研究的土壤采样时间为烟叶收获后的9—10月，青枯病已经严重发生，这导致劳尔氏菌在侵入烟株过程中或侵入后，对植株的正常代谢产生了干扰，而烟株为了抵抗这种变化，通过改变根系分泌物或内生细菌来进行调节[19]，从而造成烟株根际土壤微生物种类增加;另外，烟株感染青枯病后，根系及茎秆开始腐烂，大量有机物质进入根际土壤，微生物获得了更多的碳氮养分而使其数量增多、群落结构更加复杂[20]。根据以上结果，可推测青枯病发病前的土壤细菌群落多样性高有助于提高烟株对青枯病的抗性;而青枯病发病后，土壤细菌群落多样性趋向于更加丰富，但可能提高了有害菌群数量和丰度，反而不利于抵抗青枯病的发生。

在植物生长过程中土壤微生物群落结构起着重要作用，因为它们可以从不同的微生物群落中获益[21]。同时，植株感染青枯病后，根际土壤微生物群落会发生改变[22]。本研究表明Sphingomonas和Arthrobacter在未发病土壤中明显高于发病土壤，可能土壤中相对丰度较高的Sphingomonas和Arthrobacter等中性微生物可降低烟草青枯病的发病水平。其原因，一方面中性微生物通过竞争生态位的方式降低了有害菌群（如Ralstonia等）相对丰度（图3）;另一方面它们有效改善了土壤生态环境和养分供应状况[23-24]，促进了烟株的生长发育，进而通过增强植株抗性的方法减少了烟草青枯病的发生，具体影响机制还有待进一步研究。

生态网络关系是自然界物种间的重要属性，能直观表达物种之间的复杂关系，还可以表征微生物群落结构的稳定性[25-26]。有研究认为，模块度较低的网络，因其较短的网络距离将增加对外界干扰的传递速度，从而降低整个网络结构的稳定性[27-28]。本研究中，烟草青枯病的发生，降低了烟株根际土壤微生物网络直径、平均路径距离和网络模块性（表1）。说明烟株感染青枯病后，根际土壤微生物群落的多样性和网络结构的复杂性增加，而稳定性降低，这可能与青枯病的发生改变了核心网络物种有关系。YANG等[29]认为一些潜在的有益于植物的细菌作为微生物网络关键类群，如芽孢杆菌和放线杆菌等，可减少土传病原菌的入侵。本文中，烟株青枯病的发生使未发病根际土壤生态网络部分核心微生物由溶杆菌属（Lysobacter）变为戴氏菌属（Dyella），而Dyella与西瓜的土传枯萎病发病率呈显著正相关[30]，是一种对植物生长不利的微生物，说明有益微生物（如Lysobacter等）作为生态网络的关键类群可以降低植物土传病原菌的入侵机会，抑制青枯病的发生，而有害微生物（如Dyella等）则相反，这与前人的研究结论相似[29]。

烟草青枯病的致病力受多种因素影响。汪汉成等[31]研究表明影响劳尔氏菌致病力的关键土壤因子为温度和pH。有研究认为土壤板结、酸碱度不平衡、理化性状恶化等可能是烟草青枯病发病严重的主要原因[32-33]。本文中，未发病根际土壤pH和AP含量显著高于发病土壤，说明提高土壤pH和AP含量对降低青枯病的发病率有重要作用。

4 结 论

青枯病的发生增加了烟株根际土壤微生物群落的多样性和复杂程度，而网络结构稳定性降低。根际土壤中Sphingomonas、Arthrobacter、Pseudomonas相对丰度的降低和Ralstonia相对丰度的增加是烟草青枯病发病的重要微生物因素，土壤pH和AP是影响烟草青枯病发病的关键因子。在恩施烟区，可综合应用石灰调酸、合理增施磷肥、施用农家肥和生物有机肥、灌施生防菌剂等措施，提高土壤酸碱度，改善土壤微生物群落结构（增加有益及中性微生物相对丰度），防控烟草青枯病的发生。

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