氯霉素、孔雀石绿快速检测浅析与应用

杨雪婷，李志军，和永梅

（云南省迪庆藏族自治州维西傈僳族自治县农业农村局畜牧兽医水产服务中心 674600）

1 前言

快速检测的应用与发展一直深受检疫有关部门和市场监管部门的关注，便捷、快速、高效也成为各种检测试剂盒改进发展的目标。 目前维西县市场上的动物产品，特别是水生动物产品草鱼、鲤鱼、鲫鱼、虾、泥鳅等都需要得到及时准确地检验，人们对食品安全越来越重视， 更需要在一定程度上减少带疫病动物产品或动物体内有害残留成分对人们生活的影响。 在水产品市场上， 尽管监管机构对检测水产品中的孔雀石绿和氯霉素等有害药物残留有严格要求。 但市场监管部门、农业部门对水产的检测监管机制还有待完善，在短期利益的驱使下，水产行业仍然存在非法使用氯霉素和孔雀石绿的现象， 特别在非洲猪瘟疫情在国内发生以来，水产、禽类、牛羊等肉类占据的市场份额也在不断增加， 水产品的安全性也已成为影响食品质量安全和国际市场竞争力的重要因素。 重视食品安全也关系到人类健康。 因此，在水产市场检测监管过程中， 应该了解快速检测， 进行市场预防、检测和控制，才能快速、准确地获得结果，并维护市场食品安全。

1.1 孔雀石绿和氯霉素简介

氯霉素主要是对人和动物进行细菌感染性疾病治疗的抗生素，用于治疗的同时还产生毒副作用,对机体的免疫系统、血液循环系统健康造成威胁[3]，影响红细胞、白细胞等血细胞在血液中的动态平衡，导致粒状白细胞缺乏症,抑制红髓造血[2]。 使用该药物后在动物体内的代谢残留还会增强病菌的耐药性,对动物产品安全和人类食品健康甚至生物圈的生态平衡产生严重影响。目前，美国、欧盟、中国等国家和组织都对动物性食品中氯霉素极其代谢的有害残留量有着明确的限定， 不得在有关产品中检测出[4]。 虽明令禁止，但就目前来看，人们在养殖中对使用氯霉素治疗的依赖还难以完全摆脱，药物监管不到位，使出售到市场上的水生动物产品体内依然存在氯霉素过量残留。

孔雀石绿自身三苯甲烷类结构与它特有的毒性密不可分。因其良好的杀菌效果而被用于水产养殖。 当水生动物体从周边环境中摄入孔雀石绿， 经机体内发生生物转化代谢后主要以无色孔雀石绿的形式蓄积在水生动物的器官组织中， 整个代谢过程中在排泄组织中浓度最高[8]。 科学研究发现，使用孔雀石绿后水生动物体内易留存其代谢产物， 被人摄入吸收后能透过细胞膜，在细胞代谢过程中进入细胞核，对DNA 的双螺旋结构产生影响，诱发正常细胞癌变[6]。 无色孔雀石绿是孔雀石绿在环境中代谢的主要产物，容易在水生动物产品中孔雀石绿代谢产物残留。无色孔雀石绿使机体各项生化指标发生变化的毒性作用远远高于母体化合物，残留量更多，残留时间较更长，残留问题更应得到重视。

1.2 快速检测方法的研究现状

在氯霉素残留控制过程中，准确、便捷、快速的检测方式发挥了关键的作用。 近年来，氯霉素的检测方法得到了人们的积极探索。 从最初利用微生物进行定性检测，到如今各种先进检测技术，如酶联免疫法[3]、高效液相色谱法[9]、气相色谱法[9]等,不停地推动着食品安全监督管理事业的完善与发展。 让氯霉素的检测灵敏度、精确性、检测时限等方面的技术在以往的基础上都得到了有力提升，使氯霉素的检测极限，精密度和回收率大大提高。 胶体金免疫层析试纸条,应用免疫学竞争方法,在胶体金结合垫上使抗氯霉素单克隆抗体-胶体金复合物包被覆盖, 同时在硝酸纤维素薄膜表面包被氯霉素抗原作为检测线[7]。 当待检物中氯霉素残留达到一定限度， 就能够竞争结合胶体金标记的氯霉素单克隆抗体,能通过直观的颜色反映检测的结果[7]。适用于市场氯霉素残留检疫现场监控。

目前在无色孔雀石绿残留控制过程中，准确、快速的检测方式也发挥了关键的作用， 检测方法在快速的科学技术发展过程中日新月异。 主要有薄层色谱法[6]、分光光度法[6]等。 这些方法以定量检测残留为目标，需要大量的专业的技术人员投入，需要价格昂贵的仪器设备支持，操作要求精细，过程复杂。 在现场进行大规模的检测，要求操作简易便捷，反映灵敏，仪器、试剂盒实用价廉，用时短。 快速检测方法以免疫学方法为基础，在研究人员的大量研究、实验中均有良好的反应性，适合作为药物残留检测的快速筛选方法之一[5]。 若设立市场快速检测监控站，作为一种仅需通用仪器的快速灵敏的检测技术， 酶联免疫检测试剂盒可用于现场检测无色孔雀石绿中的药物残留。

1.3 实验目的和意义

快速检测手段的应用与发展一直深受检疫有关部门和市场监管部门的关注，便捷、快速、高效也成为各种检测试剂盒改进发展的目标。 良好的市场监管为人们的饮食健康安全提供了保障,同时为我国的食品对外贸易发挥了巨大作用。 为了保证各种水生动物产品的质量安全，能够在最短的时间内建立便捷、高效的快速检测技术来检测水产品中无色孔雀石绿与氯霉素的残留具有重要的意义。 用一种方便快速的检测手段，既保证了效率，又节省了人力，及时发现“问题产品”及时处理，也避免了对人们生活造成不必要的影响和伤害。

2 实验所需材料与原理浅析

2.1 实验仪器及试剂

电子秤、移液枪、均质器、振荡器、离心机、氮吹仪、孔雀石绿快速检测试剂盒、氯霉素快速检测试剂盒。 氯霉素快速检测试剂盒中包括：缓冲液、提取剂、净化剂、离心管（15mL 和5mL）、氯霉素快速检测卡。孔雀石绿快速检测试剂盒中包括：提取剂A、提取剂B、缓冲液、氧化剂、净化剂、离心管（15mL 和5mL）、孔雀石绿快速检测卡。

2.2 快速检测氯霉素的实验原理

氯霉素快速检测卡对水生动物组织中的氯霉素残留检出限为0.3ppb， 应用了竞争抑制免疫层析的原理使样本液中的氯霉素在与检测卡接触过程中通过竞争抑制了抗体和NG 膜检测线（T）上氯霉素蛋白偶连物的结合[7]。 在样本处理过程中，选用乙酸乙酯[1]作提取剂，提取出肌肉内脏中的氯霉素，混匀离心后氯霉素溶于上层有机相，将有机相吹干，选用正己烷做净化剂[1]，除去其中脂质分子，最后用试纸进行检测。

2.3 快速检测孔雀石绿的实验原理

孔雀石绿快速检测卡对鱼、 虾等组织中的孔雀石绿检出限为2ppb， 应用了竞争抑制免疫层析的原理使样本液中的孔雀石绿在与检测卡接触过程中，通过竞争性抑制抗体和NG 膜检测线上孔雀石绿蛋白偶连物的结合[5]。 在样本处理过程中，选用乙腈作提取剂A、中性氧化铝作提取剂B[8]尽可能有效地充分提取组织中的孔雀石绿代谢产物， 混匀离心后孔雀石绿代谢产物溶于上层有机相加入微量氧化剂，选用正己烷做净化剂，提取的成分溶于下层溶液并呈紫红色，用氮气吹干后，加缓冲液混匀待检。

2.4 快速检测结果判定

注：图中C 线为质控线，T 线为检测线。 当测试结果中C 线显色比T 线显色浅或与T 线显色相同时检测结果为阴性；当C 线显色比T 线显色深或C 线显色T 线不显色时检测结果为阳性；当C、T 线均不显色或只有T 线显色时检测结果无效。

3 市场监管和快速测试应用的前景

快速检测方法基于免疫学方法， 并采用竞争抑制免疫层析原理。 选择基于此技术的快速检测套件来进行市场监管的快速检测，并在市场食品卫生监管中做得更好，要容易得多。 此类产品应价格便宜，灵敏，快速，适合大规模现场检测，适合作为药物残留检测的快速筛选方法， 并且只需要使用普通仪器的检测技术即可进行无色孔雀石绿现场药物残留检测初步筛选测试，实验结果高度可靠。 如果发现阳性样品，样品将被送至上级实验室进行重新检查，等待结果，然后将采取相应的措施以积极应对。

快速检测卡为定性检测，整个检测过程只需要90min 左右，适用于现场监控和大量样品筛查。 操作简单，对仪器设备要求不高。 为了保证各种水生动物产品的质量安全，需要能够在最短的时间内建立便捷、 高效的快速检测技术来检测水产品中无色孔雀石绿与氯霉素的残留。 尽管快速检测手段具有快速、便捷等诸多优点，但面对定量检测等要求，其自身缺陷就显现出来，因为我们得到的只是知道鱼体内是否含有违禁药物， 具体药物残留有多少，没有定量，这是快速检测的弊端。 从基层市场监管来看，快速检测卡能够更快，更准确地做好食品安全检测，能够为监管部门从市场中把关起到良好的辅助作用， 逐渐对养殖业产生良好的促进作用。 随着科学技术的发展，会有更多先进的检验技术问世，借助这些先进的技术，有关部门就能更好地服务于市场，服务于人们。