湖南柑橘果皮总黄酮及橙皮苷含量分析

刘嘉丽，刘德明，王 丹，张 鸿，董新荣，童建华

（1. 湖南农业大学化学与材料科学学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410128；3. 湖南农业大学生物科技学院，湖南 长沙 410128）

中国是世界柑橘产量大国，2018 年全国种植面积达到260 万hm2，产量达到4 138.1 万t[1]。国内柑橘的消费主要为鲜食（55%）、榨取果汁及罐头加工（35%～40%）[2]，其中加工将产生占鲜重45%～60%的柑橘皮渣[3]。柑橘果皮富含黄酮类化合物[4]，有文献报道柑橘果皮黄酮主要为多甲氧基黄酮[5-6]，也有研究[7-11]认为主要成分为橙皮苷。

橙皮苷（hesperidin）是一种二氢黄酮苷，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管等药理活性[12]。橙皮苷在食品工业中，可用作抗氧化剂、食品添加剂、果蔬高效抗氧保鲜剂等[13]。橙皮苷主要从枳实中提取分离，国际市场前景广阔。枳实为芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）及其栽培变种的干燥未成熟果实[14]。由于产量有限，近年来枳实的市场价格暴涨，寻求新资源成为人们关注的热点。

分光光度法具有仪器易得、操作简单、测定快速等特点[15-16]，在柑橘果皮提取物及应用的研究中广泛使用[17-20]。因样品显色方式不同，分光光度法又嗑分为UV 直接比色法、碱显色比色法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色比色法等。但是从植物提取物中分析单一化合物含量最有效的方法是HPLC 法[21-22]。前期比较了橙皮苷（对照样品）与柑橘果皮提取液在不同显色方法下的紫外-可见光谱的最大吸收峰波长，认为直接比色法和碱液显色比色法适用于总黄酮的检测，与伍长春等[18]的研究结果一致。但考虑到NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法为黄酮含量测定的通用方法，故将该方法一起进行比较；另外，采用HPLC 法测定了柑橘果皮中橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷的含量，以期为柑橘果皮的资源化综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试柑橘果皮的产地、采摘时间及品种名称等信息见表1，所用橙皮苷（批号为P06D9F77001，HPLC含量≥98%）、新橙皮苷（批号为Z31J6L2067，HPLC含量≥98%）、柚皮苷（H24N9Z75869，HPLC 含量≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司，甲醇为HPLC 级试剂，其余为分析纯，试验用水为蒸馏水。

主要仪器：UV-9600 紫外可见分光光度计（北京北分瑞利分析仪器集团有限公司），KQ300-DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TDL80-2B 离心机（上海安亭科学仪器产），TP-520A 电子天平（湘仪天平仪器设备有限公司），HWS-28 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），ATY124 电子天平（SHMADZU），岛津LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品溶液制备 称取柑橘果皮样品粉末0.5 g，加入20 mL 甲醇，在210 W 的功率下超声提取30 min。过滤，收集滤液。滤渣再用同法提取一次。合并2 次滤液，用甲醇定容至50 mL。溶液以2 500 r/min 离心10 min。离心液置4℃储存备用。

1.2.2 UV 直接比色分析方法 （1）对照品溶液制备。精密称取橙皮苷对照品5.4 mg，用甲醇溶解[12]，定容于50 mL 容量瓶中，得橙皮苷对照品储备液，浓度为0.108 mg/mL。（2）标准曲线绘制。吸取橙皮苷对照品储备液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 带塞比色管中，用甲醇定容，摇匀。于282 nm 下测定吸光值。以橙皮苷浓度（mg/L）对吸光度A 绘制标准曲线。（3）样品测定。精密量取样品溶液0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。按上法测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显 色 比 色 法 （1）标准曲线绘制。吸取橙皮苷对照品储备液0.5、1、1.5、2 和2.5 mL 于10 mL 带塞比色管中，加入0.5 mol 5%NaNO2溶液，放置5 min。再加10%Al(NO3)3溶液0.5 mL，放置5 min。再加5%NaOH 试液2.5 mL，用去离子水定容至刻度线，摇匀，常温下显色15 min。于346 nm 下测定吸光值。以橙皮苷浓度（mg/L）对吸光度A 绘制标准曲线。（2）样品测定。精密吸取50 μL 各样品溶液，置于10 mL 比色管中，按上法操作测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.4 碱显色比色法 （1）标准曲线绘制。吸取橙皮苷对照品储备液1、1.5、2、2.5 和3 mL 于10 mL 带塞比色管中，加入0.5 mL 10%NaOH 溶液，用水稀释至刻度线，在60℃下水浴显色30 min，流水冷却至室温，摇匀。于360 nm 波长下测定吸光值。以橙皮苷浓度（mg/L）对吸光度A 绘制标准曲线，得到线性回归方程。（2）样品测定。精密量取不同样品溶液0.2 mL，置于10 mL 比色管中，按上法操作测定吸光值，以橙皮苷为标样计算总黄酮含量。

1.2.5 HPLC 法 （1）液相色谱条件：InertSustain-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A 为0.1% 磷酸/水溶液，流动相B 为乙腈；梯度洗脱条件为0～ 25.00 min 20% B，25.00～25.10 min 20%～100% B，25.10～ 27.00 min 100% B，27.00～27.10 min 20% B，27.10～ 32.00 min 20% B；流速1.0 mL/min；柱温35℃；检测波长283 nm；进样量10 μL。（2）标准曲线绘制。配制系列浓度的橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷混合对照样品溶液，在色谱条件下测定，以浓度（mg/L）对峰面积绘制标准曲线。（3）样品测定。按上法操作测定峰面积，以标准曲线计算指标成分含量。

2 结果与分析

2.1 不同显色方法测定柑橘果皮总黄酮的最大波长和线性方程

在200～900 nm 波长范围内对橙皮苷及样品的甲醇溶液、碱显色溶液、NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色溶液进行波长扫描，3 种方法的最大吸收波长分别为282、360 和346 nm。在最大吸收波长下，峰型对称性及吻合性较好，适合进行含量测定。

在282 nm 下直接比色测定时，橙皮苷的浓度在 5.4～21.6 mg/L 范围内与吸光度具有良好的线性关系， 线性回归方程A1=0.015 3+0.031 39 C1（R2=0.999，n=5）。 碱显色法在360 nm 波长下测定时，橙皮苷的浓度在 4.4～22.0 mg/L 范围内与吸光度具有良好的线性关系， 线性回归方程A2=-0.006 8+0.013 86 C2（R2=0.999，n=5）。 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色在346 nm 波长下，橙皮苷的浓度在8.8～26.4 mg/L 范围内与其吸光值具有良好的线性关系，线性回归方程A3=-0.064 5+0.049 93 C3（R2=0.995，n=5）。

2.2 不同显色方法测定总黄酮含量的差异性

由表1 可知，显色方法对柑橘果皮中总黄酮的分析结果有影响。这与柑橘果皮中的次生代谢产物结构有关。UV 直接比色法是在282 nm 波长下测定的吸光度，从分子结构来看，很多酚酸类在此波长下都会有吸收峰。因此，UV 直接比色法实际上测定的是提取物中酚酸类化合物的含量。NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定的原理是含有邻位羟基（或羰基）结构的物质与Al3+形成配合物而显色。因此，该方法实际上测定的是具有这种结构的多酚或者黄酮化合物的含量。而碱显色法测定的原理是利用二氢黄酮在碱性条件下转化为查尔酮显橙色，具有特殊的吸收波长。理论上来说，此法测定的是二氢黄酮的含量。但是，黄酮类化合物的分子中含有邻二酚羟基或者3,4’-二羟基取代时，在碱液中不稳定，易被氧化而颜色由黄变深红色[23]，对查尔酮的含量测定产生影响，这是否是测定结果偏高的原因，还有待进一步探讨。总之，文献中常用的比色法测定植物提取物中黄酮类化合物的含量时，均是相对比较的、一大类结构相似化合物的总量。虽然不同方法测定总黄酮含量的结果存在差异，但是，3 种方法测定的结果均提示湖南柑橘果皮含有丰富的黄酮类化合物，具有综合利用价值。

表1 柑橘果皮中总黄酮的含量

图1 HPLC 色谱图

2.3 影响柑橘果皮总黄酮含量的因素分析

柑橘的品种、产地、采摘时间均影响果皮中总黄酮的含量（表1）。首先，柑橘品种。同一产地（澧县）的柑橘皮总黄酮含量明显高于脐橙皮总黄酮的含量，柑橘早熟品种与迟熟品种的果皮总黄酮含量也存在差异（但与采摘时间有关）。第二，采摘时间。1 号样品和5 号样品为同一品种柑橘，1 号样品于10 月中旬采摘，是早熟品种刚好成熟的时期，而5 号样品于11月下旬采摘，这个时期对于早熟品种来讲果实过于成熟了。1 号果皮的总黄酮含量明显高于5 号样品，表明果实在适宜采摘时期总黄酮含量较高，过晚采摘会降低果实总黄酮的含量。第三，果皮干燥方式。柑橘果皮60℃烘干样品（2 号）的总黄酮含量明显高于晒干样品（1 号）。60℃干燥的时间短，而10 月中旬的太阳温和，干燥时间长，可能引起黄酮化合物的氧化分解。但干燥方式对脐橙果皮中总黄酮的含量影响小于柑橘果皮，这可能与脐橙果皮和柑橘果皮所含的二次代谢产物结构不同有关。

2.4 HPLC 法测定柑橘果皮中的橙皮苷含量

植物提取物一般为多种结构与溶解性类似的混合物，HPLC 分析技术在混合物单一成分的定量分析中展现出极大的优势。进一步以橙皮苷、新橙皮苷及柚皮苷为对照样品，通过HPLC 色谱条件的优化，有效实现了柚皮苷与橙皮苷的基线分离，混合对照样品及柑橘果皮提取物的HPLC 色谱图如图1 所示，图1A中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的相对保留时间分别为17.362、19.460、23.331 min。

按1.2.5 的色谱条件，橙皮苷浓度在18.50～129.50 mg/L 范围内，积分面积（y）与浓度（x）具有良好线性关系，线性方程为y=20 140.2x-3 488.16（R2=0.999 9， n=5）。

如图1B 和C 所示。湖南柑橘果皮样品主要含有橙皮苷，不含新橙皮苷及柚皮苷。这与一些相关报道的国内柑橘果皮中橙皮苷含量高的结果基本一致。

2.5 影响柑橘果皮橙皮苷含量的因素分析

如图2 所示，柑橘果皮中橙皮苷的含量也明显高于脐橙和南丰蜜橘皮，柑橘果皮中橙皮苷的含量最高可到果皮干重的7%左右；同时，柑橘果皮中橙皮苷的含量还因产地及采摘时间（如1 号样品明显高于5号样品）而存在差异。

3 结 论

紫外-可见分光光度法的测定结果表明，湖南柑橘果皮含有丰富的黄酮类物质。HPLC 分析结果表明，湖南柑橘果皮样品不含柚皮苷和新橙皮苷，橙皮苷的含量最高可达到果皮干重的7%左右，是良好的橙皮苷资源。同时，柑橘果皮中总黄酮和橙皮苷的含量可能因品种、产地及采摘时间不同而存在差异。因此，柑橘果皮作为橙皮苷的资源利用时，需要对品种、产地及采摘时间进行综合考察，以获得最好的橙皮苷原材料。

图2 HPLC 法测定不同样品的橙皮苷含量