种子汤加减方对气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠血流变学及纤维化的影响

史晓敏 齐瑶

西北民族大学附属医院，甘肃 兰州730000

不孕症是妇科常见病，在我国发病率为7%～10%，其诱发因素涉及排卵、输卵管、子宫、宫颈、阴道、免疫等，其中输卵管因素约占不孕因素的50%，输卵管发育异常、子宫内膜异位症、输卵管炎等均可导致输卵管性不孕［1］。近年来，输卵管炎性不孕发病比例有增加趋势，可能与盆腔感染增加、流产比例上升、环境污染、生活饮食习惯异常改变等因素有关［2］。西医多通过抗生素、介入再通术、腹腔镜手术、辅助生殖技术等方法治疗输卵管炎性不孕，但因创伤性较大、复发率较高、费用昂贵等，不能广泛应用于临床［3］。近年来中医药以其毒副作用少、无创性、作用持久、适应证广泛、价廉等优势受到临床广泛关注。气滞血瘀型是输卵管炎性不孕的中医证候常见分型，正所谓瘀滞阻于胞宫，精卵无法结合而致不孕［4］。种子汤是李广文教授的经验方，具有理气活血、疏肝解郁、化瘀通络、养血调经之功，用于治疗排卵功能障碍性不孕疗效显著［5］，但种子汤加减方应用于气滞血瘀型输卵管炎性不孕治疗的报道甚少。因此，本研究分析了种子汤加减方对气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠血流变学及纤维化的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雌性SD大鼠75只，健康，SPF级，周龄6～8周，体质量180g~220g，购于上海捷思英达医药技术有限公司（许可证号：SYXK（沪）2019-0031）。所有大鼠饲养于动物实验室中，每5只大鼠一笼饲养，室温维持在（25±0.5）℃，湿度维持在（55±5）%，昼夜时差控制在12h：12h，采用大鼠标准饲料饲喂，自由摄食饮水，适应性喂养一周。

对照组大鼠给予等量生理盐水；模型组大鼠建立气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠模型；按照“人与动物体表面积折算等效剂量比率表”［7］，配置对应低、中、高剂量组大鼠造模后分别给予等效成方浓度1.52g/kg、3.04g/kg、6.08g/kg剂量的种子汤加减方。每组15只。种子汤加减方浓度配置方法：C方=（m草药-m药渣）/m液。

1.2 模型制备及药物干预 气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠模型建立：腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.04mL/kg，南京森贝伽生物科技有限公司），将大鼠麻醉，碘伏常规消毒术区，在肾区脊柱两侧旁开1cm处行一横切口，打开腹腔，找到输卵管和卵巢，沿输卵管－卵巢方向，注射0.1mL金黄色葡萄球菌悬液（4×109/mL，上海恒斐生物科技有限公司）至输卵管，逐层缝合。另外一侧输卵管采用相同方法处理。大鼠术后1周给予声光电、45°斜坡、夹尾联合刺激，刺激时长为3周。声光电刺激：24～35V电击刺激，1～3kHz闪烁光刺激，5～15kHz噪声刺激，刺激时间为60～120s，每8～15min/次，持续10～12h；夹尾：使用长镊夹大鼠尾巴，60min/次，每次4min，每天8次；45°斜坡：倾斜鼠笼45°，每天2h，每天1次。造模成功［6］。造模过程中失败大鼠剔除，并随机补足。

模型组按照上述方法造模，低、中、高剂量组造模后进行治疗，种子汤加减方（红藤15g、桃仁10g、丹参30g、柴胡10g、穿山甲10g、王不留行10g、昆布10g、路路通10g、当归10g、香附10g、川芎10g、淮山药10g、龟板15g；所有中药材购于山东步长神州制药有限公司），按照“人与动物体表面积折算等效剂量比率表”［7］，配成低、中、高浓度药液，分别为浸出有效成分浓度1.52g/kg、3.04g/kg、6.08g/kg（相当于成人临床用量的5倍、10倍、20倍），灌胃体积为1mL/100g，每天1次，连续治疗28天。对照组在造模开始时给予等量生理盐水。

1.3 观察指标 分析各组大鼠血流变学：用10%水合氯醛溶液0.04mL/kg腹腔麻醉，然后在无菌条件下腹主动脉取血，采用GD3LBY-N6K自清洗快测血流变仪（北京中西远大科技有限公司）测定全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s。

观察各组大鼠输卵管组织病理变化：将各组5只大鼠处死，取输卵管组织，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋成块，组织切片机（上海玉研科学仪器有限公司）切成5μm连续切片，脱蜡水化，采用HE染色试剂盒（北京祥生兴业科技有限公司）染色，流水冲洗，烘片0.5h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶固封剂（上海经科化学科技有限公司）封片，显微镜下观察HE染色结果。

比较各组大鼠受孕率：治疗结束后，把各组余下的10只雌性大鼠和雄性大鼠合笼饲养10天，每组分配5只雄性大鼠，以观察受孕情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用F 检验，各组计量资料两两比较采用SNK-q检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠输卵管组织病理变化 对照组输卵管结构完整，黏膜清晰，无充血水肿，亦无炎细胞浸润；模型组输卵管结构异常，黏膜上皮细胞脱落，输卵管组织粘连及纤维化明显，血管壁增厚、变硬，可见血管壁充血肿胀，输卵管管腔内及输卵管周围可见大量炎细胞浸润；各剂量组输卵管组织病理变化较模型组均有不同程度的改善，其中中剂量组改善程度优于低剂量组，高剂量组改善程度优于中剂量组。见图1。

图1 各组大鼠输卵管组织病理变化（HE染色×400）

2.2 各组大鼠血流变学分析 与对照组比较，模型组和各剂量组大鼠全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s高（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量组大鼠全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组大鼠全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组大鼠全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血流变学分析（mPa.s）

2.3 各组大鼠受孕率比较 与对照组比较，模型组、低剂量组、中剂量组大鼠受孕率低（P<0.05）；与模型组比较，中剂量组、高剂量组大鼠受孕率高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠受孕率比较

3 讨论

气滞血瘀型输卵管炎性不孕在古代医学书籍中属无子、痛经、带下病等范畴。研究认为［8］，此病多因经期正行，余血未尽，胞门未闭合完全，湿热内蕴，外阴不洁，邪毒乘虚内犯，与胞宫、冲任之气血相搏结，使气血运行失调，胞脉受阻，瘀血停滞，不能摄精成孕。中医认为［9］，“瘀”是本病的发病机制，因炎症常与湿浊之邪关联，湿热缠绵日久，病久伤络，脉络不通，不能摄精成孕。《神农本草经》曰“无子多系冲任瘀血，去瘀血自能有子也”，《针灸甲乙经》曰：“女子绝子，其血在内不下，受关元主之”，提出了瘀血可致不孕的理论机制［10］。报道认为［11］，本病由摄生不慎，感外邪，情志不调，邪与血相搏结，血行不畅，冲任胞宫阻滞，精卵难于相搏而致。因此，以“活血化瘀，行气止痛”为治疗本病的基本准则。种子汤组方包括红藤、桃仁、丹参、柴胡、穿山甲、王不留行、昆布、路路通、当归、香附、川芎等，其中，丹参养血活血、化瘀消瘀，桃仁活血化瘀，红藤活血祛瘀，当归补血调经、活血行滞，川芎行气活血，开郁调肝，上述诸药均有化瘀之功，合用有加强破血消瘀作用；柴胡疏肝解郁，香附调经止痛、行气解郁，昆布和穿山甲味咸，能软坚散结，外通经络，王不留行苦泄宣通，长于通利血脉，路路通祛风通络，上述诸药合用，能使瘀血随经血而下，胞宫温养，胞脉通畅。共奏“活血化瘀通络”之功，使精卵相合而孕［12］。

本研究中，对照组输卵管结构完整，黏膜清晰，无充血水肿，亦无炎细胞浸润，而模型组输卵管结构异常，黏膜上皮细胞脱落，输卵管组织粘连及纤维化明显，血管壁增厚、变硬，可见血管壁充血肿胀，输卵管管腔内及输卵管周围可见大量炎细胞浸润，模型组大鼠全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s较对照组明显增加，模型组无大鼠受孕，提示气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠模型制备成功。此外，各剂量组输卵管组织病理变化尤其是组织纤维化较模型组均有不同程度的改善，其中中剂量组改善程度优于低剂量组，高剂量组改善程度优于中剂量组，提示高剂量的种子汤加减方具有改善输卵管病理、抗输卵管组织纤维化的作用。纤维化是指各种因素引起的组织损伤，如损伤较严重超出实质细胞的再生修复能力，则会刺激损伤部位细胞外基质大量积聚及纤维母细胞过度增殖，导致纤维结缔组织异常沉积，纤维结缔组织增生虽然能够修复损伤，但无法具备原来的实质细胞的结构与功能［13］。因此，抗输卵管组织纤维化为气滞血瘀型输卵管炎性不孕症治疗的重要环节。本研究中，全血黏度3/s、血浆黏度、全血黏度30/s随着种子汤加减方剂量的增加而减少，提示高剂量的种子汤加减方具有改善气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠血流变学的作用。本研究中，模型组、低剂量组、中剂量组大鼠受孕率较对照组明显下降，中剂量组、高剂量组大鼠受孕率较模型组明显升高，提示高剂量种子汤加减方有助于提高气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠妊娠率，改善妊娠结局。本研究结果与以往临床观察及基础研究结论相似，吕勇等［14］发现，通任种子汤治疗气滞血瘀型盆腔炎性不孕临床疗效肯定，能够改善患者临床症状与体征，缓解盆腔炎症程度，提高近期妊娠率。刘丽等［15］亦发现，中药能够改善气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠输卵管纤维化，并提高其输卵管组织中基质金属蛋白酶-9、金属蛋白酶组织抑制因子1水平。丁爱娟等［16］在种子汤治疗排卵功能障碍性不孕的临床研究中发现，种子汤能够改善患者排卵情况并提高6个月内妊娠率。

综上所述，种子汤加减方在治疗气滞血瘀型输卵管炎性不孕大鼠中，具有改善血流变学、抗纤维化、助孕的作用。但本研究样本量小，仍需进一步研究证实。