抗幽门螺杆菌的泽兰有效成分筛选

黄永毅，李如佳，黄干荣，覃艳春，李晓华，黄衍强，罗显克

(1. 右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心，广西 百色 533000；2. 广西壮族自治区民族医院消化内科，广西 南宁 530001)

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp) 是牙周炎、胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病的重要病因[1]。Hp感染人数超过全球约50%以上的人口[2]，目前主要采用抗生素进行治疗，但随着抗生素的广泛使用和滥用，Hp耐药率逐年递增，急需新的药物用于治疗[3]。从天然产物如植物、中药中筛选活性成分是研发新型药物比较快速、有效的方法[4]。我国一些传统中药具有良好的抑菌效果，不易产生耐药，且安全性高，在临床上得到了广泛的应用[5]。泽兰(Eupatorium japonicum Thunb.)是我国传统的中药材，具有清热解毒，祛瘀消痈等功效，泽兰中的一些萜类、苯并呋喃类[6]、黄酮类成分，具有明显的抑菌效果[7]。从泽兰中筛选出抗菌效果良好、成药性高的先导物颇具研究前景，但目前有关泽兰中抗Hp及其有效成分的研究尚未见报道。为此，本文主要以Hp为供试菌，筛选泽兰中抗Hp的有效成分，以期为泽兰有效成分作为先导化合物的研发等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 中药泽兰购自中药材诚实通平台、泽兰黄酮(CAS号：520-11-6)、半齿泽兰素(CAS号：855-96-9)、异泽兰黄素(CAS号：22368-21-4)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，BactoTM Brain Heart infusion(BHI)培养基、哥伦Columbia blood Agar base(G)培养基、标准小牛血清、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基购自南京晶格化学科技有限公司，Hp标准菌株由南京医科大学毕洪凯实验室赠送，Hp临床分离菌株为本实验室分离获得。

1.2 方法

1.2.1 琼脂稀释法检测泽兰水提物最小抑菌浓度(MIC90) ①水提物制备：中药泽兰准确称量重量。加水没过泽兰浸泡30 min，煎煮3次，第1次煮1 h，第2次煮45 min，第3次煮30 min。其间不断加水补充蒸发的水分，使用玻璃棒搅拌，避免糊底，每次煎煮完成后，过滤，得滤液，再加适量水重新煎煮。合并3次滤液，浓缩，真空干燥，干燥完成后放置-20℃冰箱保存备用。②琼脂板制备：将不同浓度的抗菌药物分别加入50 ml烧瓶，使培养基和药物混合后含药量分别是100 mg/ml、10 mg/ml、1 mg/ml、0.1mg/ml，药物和培养基总量为20 ml。③菌液制备及接种：取固体平板上对数期生长的菌用对应培养基制作成菌悬液，Hp调整菌液浓度为1×108CFU/ml(OD600为0.3)，备用；其余细菌调整菌液浓度为1×108CFU/ml(OD600为0.3)，稀释10倍，备用；真菌调整菌液浓度为5×106CFU/ml(OD600为0.5)，稀释100倍，备用。取1 μl接种于琼脂表面，每点菌数约为Hp为105CFU/ml，其余细菌为104CFU/ml，真菌为5×102CFU/ml。并取1 μl菌液接种于菌株原培养基作阳性对照，含药液的琼脂板作阴性对照。接种好放置相应培养箱孵育。④判断结果：当含药物未加菌的阴性对照板上细菌无生长和菌株原培养基阳性板上有菌生长实验才有意义。将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在孔琼脂表面上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。

1.2.2 微量稀释法检测有效成分最小抑菌浓度(MIC90) ①抗菌药物制备：抗菌药物贮存液浓度4000 μg/ml。②96孔板制备：第1孔先加培养基173.6 μl，其它各孔加培养基90 μl，第1孔再加6.4 μl抗菌药物，按倍稀释至第11孔；第12孔作为加菌不加药对照，保留90 μl培养基。③菌液制备：取固体平板上对数期生长的菌用对应培养基制作成菌悬液，Hp调整菌液浓度为1×108CFU/ml(OD600为0.3)，稀释10倍，备用；其余细菌调整菌液浓度为1×108CFU/ml(OD600为0.3)，稀释100倍，备用；真菌调整菌液浓度为5×106CFU/ml(OD600为0.5)，稀释1000倍，备用。④接种菌液：取上述备用菌液10 μl加至第1～10孔和第12孔(Hp工作浓度为1×106CFU/ml，其余细菌工作浓度为1×105CFU/ml，真菌工作浓度为5×102CFU/ml)，第11孔作为不加菌对照，只加无菌水。培养72 h判断结果。1～10孔药物浓度分别为128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml。⑤判断结果：当不含菌的阴性对照孔(即第11孔)内细菌无生长和有菌无药物阳性孔 (第12孔)有菌生长实验才有意义。以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC。如果出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如果出现多处跳孔，则该次结果作废，结果重复3次。

1.2.3 琼脂稀释法检测有效成分最小抑菌浓度(MIC90) ①琼脂板制备：将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入50 ml烧瓶，对应培养基在50～55℃恒温器中保持液态，按比例加入培养基，使培养基和药物混合后含药量分别是128 μg/ml、64 μg/ml、32 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml、4 μg/ml、2 μg/ml、1 μg/ml、0.5 μg/ml、0.25 μg/ml，药物和培养基总量为10 ml。②菌液制备及接种，同1.2.1。③判断结果，同1.2.1。

2 结果

2.1 泽兰水提物抑菌效果 用琼脂稀释法检测泽兰水提物最小抑菌浓度，如表1所示。发现泽兰水提物对金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌抑菌效果良好，MIC为1 mg/ml。对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌也有抑制效果，MIC为10 mg/ml。

表1 泽兰水提物抑菌效果

2.2 泽兰有效成分筛选结果 购买的3种泽兰中主要抑菌成分对两种Hp供试菌的MIC值，如表2所示。由表中MIC可知，异泽兰黄素、泽兰黄酮对Hp敏感或耐药菌株均有很好的抑制效果，MIC值为16 μg/ml。半齿泽兰素对Hp菌株未见明显抑菌效果，MIC>128 μg/ml。抑菌效果判断标准为有效成分抑菌浓度是否小于水提物抑菌浓度。

表2 泽兰中主要成分对Hp的MIC检测 单位：μg/ml

2.3 泽兰成分对18种Hp菌株MIC检测结果 异泽兰黄素、泽兰黄酮对18种Hp供试菌药敏MIC检测结果，如表3所示。琼脂稀释法验证MIC检测结果，如图1所示，异泽兰黄素和泽兰黄酮对敏感、耐药和多重耐药Hp菌株均有良好的抑菌效果，MIC值16～64 μg/ml。

3 讨论

随着抗生素的广泛使用和滥用，使得Hp耐药性逐年递增，且抗生素的不良反应越来越突出。因此，探索新型药物用于治疗是非常急迫的任务。本研究发现，泽兰水提物对铜绿假单胞菌、白色念珠球菌等菌株具有不同程度的抑制作用，对Hp抑制效果更为明显。池水晶等[8]采用不同试剂粗提泽兰，发现泽兰的提取物对金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌等具有明显的抑制效果。陈芝芸等[9]筛选100种中药发现泽兰对Hp具有很好的抑制效果。这些与我们的研究结果是一致的，但目前泽兰中具体抑制Hp的有效成分尚未见报道。

表3 泽兰成分对18种Hp菌株MIC检测 单位：μg/ml

注：3个培养基从左至右药物浓度分别为64 μg/ml、16 μg/ml、8 μg/ml。图1 不同浓度药物对Hp菌株抑制作用检测

本文为深入研究泽兰的抑菌效果，购买了3种泽兰中的有效成分，筛选出了泽兰中主要抑制Hp的有效成分异泽兰黄素和泽兰黄酮。异泽兰黄素和泽兰黄酮对敏感和耐药的Hp菌株均有较好的抑制效果，MIC值16～64 μg/ml，优于水提物的抑菌效果。现代研究表明，异泽兰黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性[10]，对一些酶也存在强烈的抑制作用[11]，但对其抑菌活性研究甚少。张菲等[12]发现包含泽兰黄酮成分的谷精草乙醇提取物对革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，但未见抑制Hp的相关报道。本研究尽管筛选出了泽兰中主要抑制Hp的有效成分，但目前还仅限于体外实验，如果能进行体内实验验证并掌握其抗菌机制，进一步提高其药效和安全性，那么将是非常理想的新型抗Hp先导化合物。

综上所述，泽兰水提物对Hp具有较好的抑制效果，泽兰中的异泽兰黄素和泽兰黄酮对敏感和耐药的Hp菌株均有较好的抑制效果，是泽兰的主要抗菌成分。