鸡骨草提取物体内抗肿瘤活性研究

李庭树，黄锁义

(1. 右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000；3. 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000)

鸡骨草(Abruscantoniensis)又名黄头草、黄仔强、大黄草、猪腰草，该植物主要在分布于广东、广西等地。鸡骨草全草除其种子外均可入药，具有利湿退黄，清热解毒，疏肝止痛等功效[1-2]，鸡骨草是一种药食两用植物，在春夏潮湿季节用来煲汤作食疗及制作凉茶等[3]。鸡骨草药理作用是多方面的，它涉及到降脂保肝[4-5]、抗菌、抗炎镇痛、增强免疫、抗氧化[6-8]、促进伤口愈合、治疗母儿ABO血型[9]不合等多种生物活性。本课题组在前期试验研究中发现鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物在体外具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的作用[10-12]，本研究通过构建SGC-7901胃癌细胞、BEL-7404肝癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型，在体内环境中研究鸡骨草乙酸乙酯、正丁醇、水提取物对裸鼠皮下移植瘤生长的影响，进而筛选出鸡骨草体内具有抗肿瘤作用的提取物，为进一步分离鸡骨草抗肿瘤的单体化合物指明方向，以及为这一传统药物的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及药材 胃癌细胞SGC-7901、肝癌细胞BEL-7404、乳腺癌细胞MCF-7均购于中国科学院昆明细胞库，鸡骨草药材均采购于广西壮族自治区百色市田林县，经右江民族医学院覃道光副教授鉴定为豆科植物广州相思子的干燥全株鸡骨草。

1.1.2 实验动物 45只SPF级BALB/c-nu雌性裸鼠，4周龄，质量12～13 g，购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK(湘)2018-0013，试验动物质量合格证：No.43006700018940，饲养于SPF级动物房内，裸鼠饲料、水均经高压灭菌处理并由动物实验室提供。

1.1.3 主要试剂 DMEM购于美国Gibco公司(批号：C11874600BT)；0.25% 胰酶(EDTA，1×) 购于北京索莱宝科技有限公司(批号：T1350)；GEMINI胎牛血清购于美国GEMINI公司(批号：G24G00J)；1×PBS缓冲液购于北京索莱宝科技有限公司(批号：P1020-500)；青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司(批号：P1400)；兔抗鼠Bax和兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体购于爱必信(上海)生物科技有限公司(批号：abs830008)；抗体稀释液购于碧云天生物科技公司(上海)(批号：P0023A)；兔二抗购于Boster生物科技公司(武汉)(批号：A32731)；各种规格离心管、巴氏滴管滴管Axygen购于USA有限公司，25 cm2细胞培养瓶购于美国Coming有限公司；电子游标卡尺购于上海远略机电设备有限公司(规格：0-150)；灌胃针购于上海赞德仪器有限公司(规格：12#)。

1.2 有效成分的提取 将干燥的鸡骨草全株粉碎成粉末状，共25 kg，取适量鸡骨草粉末和95%乙醇以13∶5 体积比混合，按以下方法进行提取：80℃恒温水浴加热回流3次，每次2 h，抽滤，合并滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到1 kg乙醇浸膏。乙醇浸膏中加入等体积的纯水，形成混悬液，再用乙酸乙酯、正丁醇等溶剂对混悬液依次进行反复萃取，直到溶剂不再显色即可停止，分别对萃取出来的溶剂进行抽滤、合并乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂提取液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到各个溶剂浸膏，分别为乙酸乙酯提取物(ethyl qcetate extract，CAE)0.25 kg、正丁醇提取物(n-butanol extract，NBE)0.24 kg、水提取物(water extract，WE)0.25 kg，用真空冷冻干燥机干燥成固体状，取出，保存于4℃冰箱中备用。

1.3 细胞培养 胃癌细胞SGC-7901、肝癌细胞BEL-7404、乳腺癌细胞MCF-7用含10%胎牛血清的 DMEM完全培养基培养，并在37℃、5%CO2的饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 肿瘤细胞移植 当培养瓶中SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞融合度约80%左右时，用胰酶消化、离心，加入DMEM基础培养基，将细胞浓度调到1×107个/毫升，将细胞悬液置于保温盒中带入SPF级实验室，用碘伏消毒裸鼠右前肢腋下皮肤，注射前轻轻混匀细胞悬液，使用1 ml注射器，针尖与皮肤呈25°进针，每只0.2 ml注射到小鼠右前肢腋下，注射完后用棉球轻轻按压进针口防止漏液。第2 d，观察小鼠的精神状态及活动情况，留意接种部位是否发炎。

1.5 实验分组及处理 接种后，仔细观察肿瘤的生长情况，用电子游标卡尺测量裸鼠肿瘤体积的变化，当体积达到50 mm3时，按随机原则，将每种肿瘤细胞的裸鼠分为10组，每组6只，各组给药剂量、方式、时间见表1。

表1 动物分组及药物处理

1.6 观察和测量 每日观察记录小鼠的活动、饮食、饮水、排泄物、精神状态以及肿瘤生长情况。给药后第1 d、4 d、8 d、12 d、16 d、21 d，用电子游标卡尺测量裸鼠肿瘤最长径和最短径，肿瘤体积按公式 V(mm3)= a × b2/2计算，a为肿瘤最长直径(mm)，b为肿瘤最短直径(mm)。第21 d，采用颈椎脱臼法处死裸鼠，将裸鼠的肿瘤组织剥离，除净肿瘤组织周围的结缔组织，用生理盐水将血渍洗掉并用吸水纸吸干表面水分，称重并按公式计算肿瘤抑瘤率(%)=(模型组平均瘤质量-给药组平均瘤质量)/模型组平均瘤质量×100%，计算肿瘤的抑瘤率。取瘤组织作常规固定，石蜡包埋，切片，HE染色后观察组织病理学。

1.7 免疫组织化学检测Bax和Bcl-2蛋白的表达 取出蜡块切片后染色。肿瘤组织中Bax和Bcl-2的阳性反应表现为肿瘤组织阳性细胞的细胞膜、细胞质和细胞核的核膜上呈现棕黄色或黄色颗粒。每组选择2只裸鼠分别检测1张切片，200倍显微镜下观察。使用Image-Pro Plus(IPP)6.0图像分析系统对随机拍摄的6个高倍视野图像进行定量分析，计算积分光密度值(integrate optical density，IOD)，取平均数，即为免疫组化表达的结果。

2 结果

2.1 CAE、NBE、WE对SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 为了研究鸡骨草CAE、NBE、WE在体内抗肿瘤的效果，实验采用SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞注射于裸鼠皮下，形成带有恶性肿瘤的裸鼠，通过观察鸡骨草CAE、NBE、WE处理后肿瘤生长的快慢、肿瘤体积和瘤重的大小，从而评价鸡骨草CAE、NBE、WE体内抗肿瘤的效果。经14 d的观察与统计，笔者发现3种肿瘤细胞的肿瘤组织在裸鼠体内的生长受到了鸡骨草CAE、NBE、WE的抑制，并呈现出剂量依赖性。对比3株肿瘤细胞在体内生长的情况，结果显示NBE、CAE对不同的肿瘤细胞在体内生长的抑制强度不同，CAE和NBE对3株肿瘤细胞移植瘤的抑制强度大小为：BEL-7404>SGC-7901>MCF-7，而WE对不同的肿瘤细胞在体内生长的抑制强度基本上是相同的。CAE、NBE、WE在体内抗肿瘤活性大小为：CAE>NBE>WE。

2.2 鸡骨草CAE、NBE、WE对SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 鸡骨草CAE、NBE、WE处理SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，与模型组相比，CAE低、中、高剂量组和NBE中、高剂量组移植瘤体积和瘤重均减小(P<0.05)，抑瘤率与给药剂量成正比，呈剂量依赖性。和CAE、NBE相比，WE抑瘤效果较弱，仅WE高剂量组的移植瘤体积和瘤重与模型组相比有统计学意义(P<0.05)，见表2、图1。CAE、NBE、WE高剂量组对SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为43.64%、30.68%、10.68%。折线图的斜率越大则肿瘤生长越快，斜率越小则肿瘤生长越慢，与模型组相比，CAE、NBE、WE组移植瘤生长缓慢，以CAE组移植瘤生长最慢，见图2。综上所述，鸡骨草CAE、NBE、WE对SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制强度大小为：CAE>NBE>WE。

表2 CAE、NBE、WE对SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 (n=6)

注：与模型组比较，***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。图1 CAE、NBE、WE对SGC-7901 细胞裸鼠皮下移植瘤瘤重的影响

图2 CAE、NBE、WE处理后SGC-7901 细胞裸鼠皮下移植瘤的生长曲线

2.3 鸡骨草CAE、NBE、WE对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 鸡骨草CAE、NBE、WE处理BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，与模型组相比，CAE组和NBE组移植瘤体积和瘤重均显著减小(P<0.05)，抑瘤率与给药剂量成正比，呈剂量依赖性；和CAE、NBE比，WE抑瘤效果较弱，仅WE高剂量组的移植瘤体积和瘤重与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表3和图3。其中CAE、NBE、WE高剂量组对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为47.35%、33.19%、9.29%。与模型组相比，CAE、NBE、WE组移植瘤生长缓慢，以CAE组移植瘤生长最缓慢，见图4。综上所述，鸡骨草CAE、NBE、WE对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制强度大小为：CAE>NBE>WE。

表3 CAE、NBE、WE对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 (n=6)

注：与模型组比较，***P<0.001；**P<0.01； *P<0.05。图3 CAE、NBE、WE对BEL-7404细胞 裸鼠皮下移植瘤瘤重的影响

图4 CAE、NBE、WE处理后BEL-7404细胞 裸鼠皮下移植瘤的生长曲线

2.4 鸡骨草CAE、NBE、WE对MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 鸡骨草CAE、NBE、WE处理MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤21 d后，与模型组相比，CAE低、中、高剂量组和NBE中、高剂量组移植瘤体积和瘤重均减小(P<0.05)，抑瘤率与给药剂量成正比，呈剂量依赖性。WE和CAE、NBE相比抑瘤效果较弱，仅WE高剂量组的移植瘤体积和瘤重与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表4和图5。其中CAE、NBE、WE高剂量组对MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤的抑瘤率分别为29.53%、22.22%、6.43%。与模型组相比，CAE、NBE、WE组移植瘤生长缓慢，以CAE组移植瘤生长最缓慢，见图6。综上所知，鸡骨草CAE、NBE、WE对MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制强度大小为：CAE>NBE>WE。

表4 CAE、NBE、WE对MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤的影响 (n=6)

注：与模型组比较，***P<0.001；**P<0.01； *P<0.05。图5 CAE、NBE、WE对MCF-7细胞 裸鼠皮下移植瘤瘤重的影响

图6 CAE、NBE、WE处理后MCF-7细胞 裸鼠皮下移植瘤的生长曲线

2.5 HE染色结果 HE染色是组织学中使用最基础、最广泛的技术方法之一，常用于组织形态结构的观察，在200倍数的光镜下观察HE染色。SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤模型组肿瘤细胞均匀、排列密集、生长状态良好、细胞核深染、呈圆形或卵圆形、大小不一，肿瘤细胞形态正常；鸡骨草CAE、NBE、WE组肿瘤细胞呈不同程度的弥散性分布、红染、碎片状的干酪样坏死、模糊不清等现象，说明鸡骨草CAE、NBE、WE均能使SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤中的肿瘤组织发生坏死；在同种肿瘤细胞移植瘤的HE染色中，CAE高剂量组肿瘤组织发生的坏死现象比NBE、WE高剂量组明显，其中以BEL-7404细胞移植瘤中CAE高剂量组最为明显，WE高剂量组肿瘤组织发生的坏死现象比CAE、NBE高剂量组较轻，见图7～图9。综上所述，鸡骨草CAE高剂量组诱导SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞移植瘤组织发生坏死的作用最强，且对BEL-7404细胞移植瘤最敏感，鸡骨草WE高剂量组诱导SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞移植瘤组织发生坏死的作用最弱。

2.6 CAE对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 Bcl-2和Bax的阳性反应为肿瘤组织阳性细胞的细胞膜、胞质和核膜上出现棕黄色或黄色颗粒，随着CAE给药剂量的增大，肿瘤组织Bcl-2阳性细胞减少，Bax阳性细胞增多，肿瘤细胞密度减小。CAE中、高剂量组肿瘤组织Bcl-2蛋白的IOD比模型组低，差异有统计学意义(P<0.001)。CAE中、高剂量组肿瘤组织Bax蛋白的IOD比模型组高，差异有统计学意义(P<0.01)，CAE低剂量组肿瘤组织Bcl-2、Bax蛋白的IOD和模型组比差异无统计学意义(P>0.05)，见图10～图12和表5。Bcl-2/Bax的比值随着CAE给药剂量的增大而减小，表明CAE可上调Bcl-2和下调Bax蛋白的表达。

图7 CAE、NBE、WE对SGC-7901细胞裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响(200×)

图8 CAE、NBE、WE对BEL-7404细胞裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响(200×)

图9 CAE、NBE、WE对MCF-7细胞裸鼠皮下移植瘤组织形态的影响(200×)

图10 CAE对BEL-7404细胞肿瘤组织Bcl-2蛋白表达的影响(200×)

图11 CAE对BEL-7404细胞肿瘤组织Bax蛋白表达的影响(200×)

注：与模型组比较，***P<0.001；**P<0.01。图12 CAE对BEL-7404细胞肿瘤组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

表5 CAE对BEL-7404细胞肿瘤组织Bcl-2、 Bax蛋白的表达的影响 (n=6)

3 讨论

随着近代医学发展的需求，裸鼠皮下移植瘤模型被建立[13-14]，尤其在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价、有效药品筛选等实验方面的应用。裸鼠无毛缺乏胸腺，T淋巴细胞少，无细胞免疫功能，对异体移植物不发生细胞毒效应或反应甚小，肿瘤移植生长良好，可保持肿瘤细胞原有的形态和生物学特性，是人源癌细胞异种移植的最佳实验动物。体内实验是有效药品的筛选和研究开发新药的依据[15]。在药物抑制肿瘤的机制研究中，肿瘤细胞的凋亡是一大研究热点[16]，研究表明[17]，细胞凋亡受到多种基因的调控，是一个多种抑制因素和促进因素共同作用的过程。Bcl-2和Bax是尤为重要的调亡相关基因，Bcl-2是抑制细胞调亡的基因，Bax是促进细胞调亡的基因。有研究表明[18]，Bcl-2和Bax的比值大小决定了细胞是否发生调亡，Bcl-2高表达时，抑制细胞凋亡，当Bax高表达时，促进细胞凋亡。

鸡骨草是民间常用于清利肝胆湿热的中药，其复方胶囊在临床上广泛应用；抗肿瘤研究也有报道[19]，但鸡骨草抗肿瘤的药效活性单体化合物还未明确。课题组前期研究发现鸡骨草CAE、NBE、WE在体外具有良好的抑瘤效果，且在体内安全性高。本文在课题组前期研究的基础上对鸡骨草CAE、NBE、WE进行体内抗肿瘤活性研究，采用裸鼠作为SGC-7901、BEL-7404、MCF-7 细胞的接种对象，在裸鼠的右前肢腋下的皮下接种SGC-7901、BEL-7404、MCF-7细胞，成瘤率达到100%，治疗结束后摘除移植瘤并进行相关的实验，实验结果表明：鸡骨草CAE低、中、高剂量组和NBE中、高剂量组及WE高剂量组能有效地抑制移植瘤在裸鼠体内的生长，和模型组相比具有统计学意义，以鸡骨草CAE抑瘤作用最强。免疫组化Bcl-2、Bax蛋白检测结果显示，鸡骨草CAE能抑制Bcl-2蛋白的表达，促进Bax蛋白的表达，导致Bcl-2/Bax降低，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。本研究揭示了鸡骨草体内抗肿瘤作用的物质基础，对于进一步分离抗肿瘤单体化合物，药材开发成抗肿瘤创新药物奠定基础。