去泛素化酶BRCC3的研究进展

张聪慧，徐绍业，秦坤，韩雨，邵晓云,3*

(1.桂林医学院基础医学院人体解剖教研室，广西 桂林 541100；2.桂林医学院科学实验中心，广西 桂林 541100； 3.广西脑与认知神经科学重点实验室，广西 桂林 541100)

0 引言

蛋白质翻译后修饰参与人体细胞的生命活动，包括甲基化、磷酸化、泛素化修饰等，其中泛素化修饰在蛋白质调节中扮演了重要的修饰方式角色。去泛素化酶通过分开泛素分子和蛋白底物，单个泛素分子重新进入细胞循环中，重新进行去泛素化调节。BRCC3属于JAMM金属结构域家族，是一种损伤应答调节基因，在多种组织器官中表达，参与DNA损伤修复、免疫调控等多条通路，影响胶质细胞瘤、宫颈癌、骨质疏松等多种疾病的病理生理过程。本文综述了近年来关于去泛素化酶BRCC3在作用机制和疾病进程方面的研究进展。

1 基本概念

1.1 泛素

泛素(Ubiquitin，Ub)含有76个氨基酸，存在于结构保守的蛋白家族中，调节真核生物体内的小分子蛋白质的一系列过程。通过其C端以单体形式与目标蛋白上的赖氨酸残基结合[1]。泛素通过与其他蛋白的共价结合来实现其功能，从而改变靶蛋白的稳定性和活性。泛素可以识别跨膜蛋白，参与膜泡运输。泛素分子与靶蛋白相结合发挥功能通过多个方面参与细胞生命活动：细胞分裂、细胞生长、信号转导及凋亡[2]。

1.2 泛素化与去泛素化(Deubiquitin)

泛素化是指蛋白质中的泛素分子标记靶蛋白并修饰其活性的过程。泛素化是人类细胞生命活动中蛋白质翻译修饰的一个重要调节方式，是蛋白质活性和功能的关键调节器。泛素由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶调节[1]。泛素化已经成为许多生理过程的重要调节方式，包括蛋白质定位、炎症免疫、分化、信号转导、受体内吞和运输等。去泛素化是泛素的逆向过程，是指特异性的水解酶去除与靶蛋白和泛素结合的泛素分子。

1.3 泛素化酶和去泛素化酶

蛋白质的泛素化是由泛素-蛋白酶体系统介导作用的，该系统被广泛认为是一种通过调节人体内各种蛋白质表达功能水平的重要机制。由泛素、E1、E2和E3、26S蛋白酶体(Proteasome)和泛素解离酶共同组成，E3是通过识别同源底物中的特定序列和结构元件，通过与底物共价修饰来调节。E1通过ATP供能激活泛素分子，E2结合激活的泛素分子，E3识别E2上的靶蛋白并对其进行泛素化修饰，在泛素的C端和底物的Lys残基之间形成异肽键[3]。泛素化可以产生得到泛素聚合物中大量的结构信息，生成泛素链[4]。多聚泛素化蛋白可被去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes，DUBs)去除。去泛素化酶去除泛素与底物蛋白的连接，将单个的泛素分子从泛素化蛋白底物上剥离，进入细胞内重新调节[5-7]。26S蛋白酶体是一种可以同时识别Lys48和Lys63位连接的泛素化蛋白，Lys48连接的蛋白质泛素化较为常见。通常K48结合的蛋白会被转移到26s蛋白酶体直接结合降解；而Lys63连接的多聚泛素化则与蛋白质降解无关，K63位点参与调控细胞内NF-kB、内吞自噬等信号转导过程、核糖体功能等[8,9]。

2 去泛素化酶分类以及BRCC3蛋白

人类基因组编码近100个去泛素化酶，可划分为以下五个不同的家族：卵巢肿瘤蛋白酶(Ovarian tumor protease，OUT)，这一类蛋白酶与其他类型去泛素化酶氨基酸序列不 一 样，与USP家 族 相 似；Josephin域(Josephin domain，MJD)发现Ataxin-3可以水解泛素溶解酶；泛素C末端水解酶(Ubiquitin C-terminal hydrolase，UCHs)属于半胱氨酸蛋白酶；泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease，USP)包括组氨酸盒和赖氨酸盒两个片段；JAMM/MPN金属酶(Josephin and JAB1/MPN/MOV34 metalllo enzyme，JAMM)结构域家族，具有MPN序列，能结合泛素化蛋白上的泛素分子。

JAMM家族由许多锌依赖性金属蛋白酶组成，二价锌离子与2个组氨酸和1个天冬氨酸共价结合。目前发现第六种去泛素化酶——单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein)属于半胱氨酸蛋白酶[10]。目前已知JAMM家族的去泛素化酶至少包含POH1，CSN5，BRCC36，AMSH，AMSH-LP五种。

人BRCC36(BRCA1-BRCA2-containing complex subunit 36，小鼠BRCC3的同源物)属于去泛素化酶JAMM家族成员之一[1,12,13]，它广泛表达于心脏、脑、肌肉、肾脏以及小肠等器官。BRCC36是BRCA1-A和BRISC两种多蛋白复合物的催化亚基，前者通过调节DNA修复途径的选择来保护基因组的完整性，后者服务于细胞应激反应和免疫信号功能。小鼠BRCC3 (BRCA1-BRCA2-containing complex 3)作为BRCC的亚基之一，有10个转录物(剪接变异)，3个副核苷类，204个正交物[2,5,11]。BRCC3开放阅读框架由529个氨基酸组成，该蛋白序列保守性较高。作为一种新的细胞周期调控分子，具有去除Lys-63位泛素链的特异性活性。

3 去泛素化酶BRCC3及其作用机制

BRCC3基因是一种损伤应答调节基因，广泛分布于心脏、脑、肌肉、肾脏和小肠等，参与细胞信号转导、细胞周期进程调控[13]及DNA损伤修复[14,15]过程，修饰方式和某些心血管疾病[16]、肿瘤的发生[17]及炎症小体激活密切相关[18]。然而BRCC3蛋白稳定性的调控机制尚不清楚，研究证明BRCC3主要是通过泛素-蛋白酶体途径降解的。ABRO1是BRCC36异肽酶复合体(BRISC)的一个亚基，它与E3泛素连接酶WWP2竞争性结合BRCC3，使得WWP2无法介导BRCC3泛素化，从而保持蛋白稳定[19-22]。

人BRCC36(鼠同源物BRCC3)是由BRCC3基因编码的一种多肽，广泛表达于人体的大脑、脾、肾脏等多种器官组织。该蛋白是一种锌依赖性去泛素化酶(DUBs)，可识别赖氨酸K63位残基相互连接形成的泛素链从而进行去泛素化修饰。研究结果发现[4,5,23]，JAMM家族介导的BRCC36在NF-KB细胞信号转导、先天免疫、细胞周期调节中发挥重要作用。有研究结果发现[11]，细胞内BRCC36主要参与形成BRCC(BRCA1/BRCA2-containing complex)和BRISC(BRCC36 containing isopeptidase complex)两种蛋白复合物，与MPN序列结合介导去泛素化功能，由损伤反应BRCA1-Rap80复合物和Cy-卵胞浆BRCC36异肽酶复合物(BRISC)两种不同的蛋白复合物组成。Feng等[5]在该文中发现除了BRCA1-A复合物(包括RAP80、CCDC98/Abraxas、BRCC45/BRE和MERIT40/NBA1外，发现BRCC36与另一相关蛋白KIAA0157结合。该蛋白与CCDC98在N末端序列同源性达39%，KIAA0157主要定位于胞浆，激活胞浆中的BRCC36，表明支架蛋白参与BRCC36活性的调节。目前JAMM类金属蛋白酶包括POH1(人PAD1同源物，酵母中称为Rpn11)、CSN5(COP9信号体亚单位)、BRCC36、AMSH/AMSH-LP[24,25]，JAMM需要与多亚基复合物相互结合作用才能激发活性，POH1通过形成26S蛋白酶体可进行泛素化修饰、CSN5拥有去泛素化活性需要通过形成COP9信号体，AMSH和AMSH-LP自带去泛素化活性[2]。BRCC36蛋白需要与其他亚基结合才能形成泛素化链发挥对蛋白的去泛素化作用，因为没有与泛素链直接结合的结构域[5,26]。

4 去泛素化酶BRCC3的功能

4.1 参与DNA损伤修复

BRCA1促进DNA双链断裂(DSB)修复是通过同源重组来进行的，保护DNA复制叉[27-30]。在这项研究中表明BRCC36是一种Lys-63链特异的DUB，H2A组蛋白是BRCC36的底物之一，BRCC36和DUSP3与DNA损伤反应有关，而USP3属于USP家族，USP3的缺失可使H2A和H2B发生泛素化从而保护DNA免受损伤[5,28,29]。BRCC36的去泛素化活性可在DNA双链断裂中具有泛素识别和修复作用，可微调DNA修复。BRCC36是使BRCA1-A复合物有去泛素化活性的亚基，降低BRCC36的去泛素化活性可以减少BRCA1-A在DSB上的积聚，减少积聚有利于DSB末端切除不受BRCA1-A的抑制，DNA修复即可进行[30]。

4.2 参与信号通路泛素化调节参与炎症

泛素由赖氨酸残基与单体泛素相互作用连接形成泛素链，前期通过研究K48和K63赖氨酸发现K48连接蛋白底物能被蛋白酶体识别降解，K63则是参与蛋白活化和信号传导。Singh等[31]实验发现在巨噬细胞中siRNA转染敲低BRCC36，结果显示NLRP3炎症小体、Caspase-1和IL-1β分泌水平显著降低，表明BRCC36可以调节炎症小体活性，同时也发现在OX-LDL诱导刺激下炎症小体活性激活是通过BRCC36得以实现的，证明了BRCC36可能是参与OX-LDL激活炎症小体的重要分子。抑制BRCC36去泛素化活性可抑制NLRP3炎症体的激活，这可能是抑制炎症发生的潜在靶点。研究表明BRCC3能够调节NLRP3活性，用G5去泛素化小分子抑制剂可抑制NLRP3的炎性活性，通过去泛素化来调节NLRP3炎症体，提供了炎症性疾病潜在的NLRP3泛素化治疗靶点[19]。另有研究发现BRCC3在帕金森病模型中的表达增加，用shRNA慢病毒敲除BRCC3可使NLRP3神经元炎症体减少，抑制BRCC3可减少IL-1β的分泌，进一步证明NLRP3炎症的激活的通过去泛素化机制调节的，确定了BRCC3是NLRP3泛素化活性的关键调节因子[35]。该研究首次证实BRCC36在HT1080细胞水平具有抗病毒效应且不依赖于去泛素化活性，U3A细胞中缺少STAT1则不具有抗病毒效应，推测BRCC36抗病毒作用可能是依赖STAT1，并发现BRCC36能与STAT1相互作用，通过USP13上调STAT1蛋白水平，发现BRCC36能够通过去泛素化酶调节STAT1的泛素化[36]。

4.3 参与先天免疫(眼表炎症)干眼模型中，发现眼表上皮细胞一种新的天然免疫途径

应对环境应激，氧化线粒体DNA能够通过刺激Caspase-8和BRCC36进而激活NLRP3/NLRP6炎性小体。激活的NLRP3和抑制的NLRP6刺激caspase-1的激活，刺激白介素-1β和白介素-18的成熟和分泌[37]。在BRISC中，BRCC3参与去泛素化，从而调节不同的靶蛋白，包括NLRP3和1型干扰素(IFN)受体链1(IFNAR1)。BRCC3表达水平降低与NLRP3和白细胞介素(IL-1β)降低有关[13,19]。

5 去泛素化酶BRCC3对疾病的影响

5.1 胶质细胞瘤

Humphreys等[38]发现PARK2是一种E3泛素连接酶，在胶质细胞瘤(glioblastoma，GB)中常发生突变和缺失，PARK2连接酶可以直接通过泛素化调节EGFP在蛋白水平上的表达，通过间接转录调节mRNA水平的表达[39]。

BRCC3除了在DNA损伤修复中发挥作用外，还参与细胞因子信号转导和调控等其他细胞途径。BRCC3作为BRISC复合体的一部分，使其底物IFNAR1去泛素化，从而影响干扰素信号。发现BRCC3突变减弱了IFNAR1的DUB活性，导致AML细胞中干扰素反应减弱。证明BRCC3突变通过削弱IFNAR1的去泛素化和功能使AML细胞对干扰素α介导的毒性不敏感。在急性髓细胞白血病细胞中，BRCC3失活导致炎症小体活性减弱，IL-1β释放减少，BRCC3突变可使其底物发生泛素化改变和细胞因子释放增加[40]。

5.2 宫颈癌

本研究结果表明，在宫颈癌组织、HeLa、Siha和C33A宫颈癌细胞中BRCC3表达水平均有所升高。BRCC3通过上调E-cadherin表达水平和下调Vimentin、MMP-2、MMP-9、SNAI1和SNAI2表达水平。研究结果提示BRCC3是一个与宫颈癌相关的癌基因，也可能成为宫颈癌患者诊断、治疗和预后的一种新的治疗生物标志物[41]。BRCA1基因编码1863个氨基酸蛋白，BRCA1是早发性乳腺癌的一个易感基因[31,32]，BRCC3在多种乳腺肿瘤中过表达。发现BRCA1参与卵巢癌凋亡、自噬和耐药性[33,34]。

5.3 骨质疏松

Cai等实验结果得到三个可能与骨质疏松症相关的基因：BRCC3、UBE2N和UBE2K。骨质疏松症患者分离的成骨细胞UBE2N和UBE2K mRNA与正常对照组相比无明显变化，而BRCC3 mRNA显著升高。此外，BACC3过表达后发现成骨分化受到抑制，且β-catenin表达降低。表明BRCC3可参与骨质疏松发生分化[42]。

5.4 烟雾病综合征

烟雾病是由于去除MTCP1/MTCP1NB和BRCC3导致Xq28减少。还发现在斑马鱼中BRCC3敲除后，血管生成缺陷，这些缺陷可以通过内皮特异性的BRCC3表达来弥补。这些结果均表明BRCC3，作为一种去泛素酶，细胞BRCA1和BRISC复合体的一部分，在血管生成中起着重要的作用[43]。

5.5 心脏病泛素-蛋白酶体系统 (UPS)

通过靶向降解信号和结构蛋白来影响心肌细胞的结构和功能，在早期心脏重塑和病理性肥大中，蛋白酶体抑制可以限制疾病进展，通过改变基因、药物等来增强蛋白酶体活性可改善心肌病和心肌梗死患者由于心脏和UPS功能受损预后，蛋白酶体抑制剂首次应用于检测UPS在心脏病表型中的作用，可作为新的治疗药物[44]。ABRO1在心肌细胞中高表达，心肌梗死时表达增加，有助于心脏保护作用[45]。

5.6 鼻咽癌

研究结果显示鼻咽癌患者中BRCC3表达增高，且与患者预后不良有关。敲除BRCC3基因可降低鼻咽癌细胞的放射抗性，敲除BRCC3基因后，鼻咽癌细胞增多，DAN修复能力减弱，细胞周期停滞与G2/M期，这些发现提示BRCC3可作为鼻咽癌的预后生物标志物和新治疗靶点[8]。

5.7 骨髓增生

异常髓系肿瘤检测中发现BRCC3基因体细胞突变，各种髓系肿瘤中共发现了28个突变，MDS和MDS/MPN中BRCC3突变更为常见，且BRCC3突变与-γ异常有关，在MDS和MDS/MPN中发现了BRCC3新的体细胞突变和其他BRCA1-A复杂成分的缺失。小鼠LSK细胞中BRCC3基因敲除后肿瘤细胞增加近一倍，转染BRCC3shRNA后造血干细胞分化能力减弱，BRCC3的突变可促进白血病可能与这些病变对肿瘤的影响有关。这些研究结果都充分提示BRCC3能够在治疗骨髓增生异常可以发挥作用[18]。

6 结语

去泛素化酶家族拥有多个家族成员，BRCC3在DNA损伤修复、细胞信号转导、烟雾病、宫颈癌、心脏病等疾病中发挥去泛素化作用，进而影响细胞病理生理进程，通过综述去泛素化酶BRCC3的作用机制及在疾病中的作用，从而有利于将BRCC3作为重要的泛素化靶点基因开发对应的药物，提供新的治疗视角。