响应面法优化核桃花茶浸提工艺

曹智翔，李升云，于晨晨，田益玲,2,3

（1. 河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071000；2. 河北省（邢台）核桃产业技术研究院，河北 邢台 054000；3. 河北省核桃工程技术中心，河北 邢台 054000 ）

核桃（Juglans regiaL.）为胡桃科胡桃属植物，在全球广泛种植。有研究报道称核桃雄花产量与核桃相当，核桃雄花提取物在中国民间被用于治疗各种疾病，如癌症、皮炎、湿疹、慢性支气管炎等疾病［1］；核桃雄花醇提物能够降血糖，提高糖尿病大鼠胰高血糖素水平［2］；核桃雄花中多酚、黄酮含量丰富，含有多个天然活性基团，具有预防心脑血管疾病、抗衰老、抗氧化、降血脂等功能［3-4］，核桃雄花中存在大量的生物活性化合物，其提取物能够预防太阳紫外辐射对人体皮肤造成的损伤［5］；此外，核桃雄花中氨基酸种类丰富，富含对人体有益的多种矿质元素及维生素。目前对核桃的研究多集中于核桃仁、核桃壳、核桃青皮及核桃叶，而对核桃雄花的研究鲜有报道，市场上对核桃雄花的认知度较低，对核桃花茶中的功能性成分及其冲泡工艺的研究很少。

多酚、黄酮具有清除自由基的功效，能够预防及治疗心脑血管、高血压等多种慢性疾病，在临床上应用广泛［6］，而游离氨基酸对茶叶品质具有一定的影响，茶叶香气和滋味均与之有关［7］，此外，游离氨基酸可被人体直接吸收，是VE、叶酸等营养素的良好来源［8］。浸提工艺会影响茶叶的相关品质指标，考虑到温度、时间及茶水比之间的交互作用尚不明确，且核桃花茶中的主要溶出物含量尚无数据支撑，本文依据其产量高、储存时间短、开发利用度低以及营养价值高的特点，将核桃雄花按照制茶工艺制成核桃花茶，采用单因素试验、Box-Behnken试验设计和响应面分析对核桃花茶浸提工艺进行优化［9］。为核桃雄花的开发利用提供一定的理论指导，对核桃花茶的浸提工艺进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻核桃‘京艺1 号’雄花，河北省河北绿岭有限公司生产基地（东经114°4′，北纬37°3′）。

没食子酸及芦丁标准品、水合茚三酮、福林酚 北京索莱宝科技有限公司；Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、Na2CO3、无水乙醇等试剂，福晨（天津）化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

UV-1700PC 紫外可见分光光度计，上海美析仪器分析有限公司；DD-8M2 冷风机，大华制冷设备有限公司大华制冷设备厂；LG10 型冷冻干燥机，新阳速冻设备制造有限公司；高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃花茶的制备 选择新鲜的核桃雄花水洗、沥干，经真空冷冻干燥后，置于粉碎机中粉碎，炒青，备用。

1.3.2 核桃花茶主要成分的测定

（1）多酚含量的测定

多酚含量的测定采用福林酚比色法［10］，以没食子酸为标准品绘制标准曲线，结果以没食子酸当量（mg/g 干物质）来表示，每个处理重复3 次。

（2）黄酮含量的测定

黄酮含量的测定采用亚硝酸钠—硝酸铝比色法［11］，以芦丁为标准品绘制标准曲线，结果以芦丁当量（mg/g 干物质）来表示，每个处理重复3 次。

（3）游离氨基酸含量的测定

游离氨基酸含量的测定参照GB/T 8314—2013 ＜茶：游离氨基酸总量的测定＞，每个处理重复3 次。

1.3.3 单因素试验与响应面优化试验 分别考察时间、温度、茶水比对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响，试验过程如下：准确称取1 g 制备好的核桃花茶于茶包中，在浸提时间（5、10、15、20、25、30、35、45、60 min），茶水比（1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150、1∶175、1∶200 g/mL）， 浸提温度（60、70、80、90、100 ℃）的条件下浸提，浸提结束后过滤并准确移取一定体积的浸提液，分别对比分析各因素不同水平的测定结果。

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken 中心组合试验设计原理，采用三因素三水平进行响应面优化分析，核桃花茶试验因素与水平参见表1。

表1 核桃花茶浸提液的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design of walnut flower tea extract

1.4 数据处理与统计分析

本试验所得数据以平均值±标准偏差（x±s）来表示，每个处理重复3 次，利用Origin 86、Expert-Design 8.0.6 软件进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸提时间对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响 多酚、黄酮等化合物会受到光、热等物理化学反应的影响，加工时间和加工方式都会影响食品中多酚、黄酮等化合物的提取［12］，而浸提时间对核桃花茶中有效成分的提取也具有一定的影响。由图1 可知，随着浸提时间的延长，多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量逐渐增加，黄酮与游离氨基酸浸提量随浸提时间的延长增加明显，而多酚浸提量随时间的延长呈缓慢增长趋势，45 min 时核桃花茶中的黄酮、游离氨基酸浸提量达到峰值，随时间的延长不再有增长趋势，反而有下降趋势，研究结果与Bengardino 等人的研究结果［13］一致，提取时间太长会导致多酚、黄酮等化合物之间发生缩合反应，部分多酚、黄酮等化合物会被氧化。

2.1.2 浸提温度对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响 温度会影响多酚、黄酮等化合物的溶出，适宜的温度会加速分子的运动，多酚、黄酮等分子的扩散速率也会加快［14］，提取温度会对化合物组成和生物活性产生影响［15］。在浸提时间为30 min，茶水比为1∶100，浸提温度不同的条件下，核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸的浸提量影响不同。由图2 可知，游离氨基酸随浸提温度的升高其浸提量变化不明显，60 ～90 ℃平缓增长，90 ℃时呈降低的趋势，而多酚、黄酮的浸提量随温度的升高，其浸提量逐渐增加，且变化趋势基本一致，但温度太高会导致杂质的溶出且有益成分易遭到破坏，影响浸提物的质量，因此本研究90 ℃的浸提温度较适宜。

图2 浸提温度对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.1.3 茶水比对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响 茶水比会影响核桃花茶有效成分的溶出，多酚、黄酮通常与植物中的大分子物质结合成稳定的物质，而不同体积分数的溶剂会影响植物多酚的提取［16］，本试验探讨浸提时间30 min，温度80 ℃，茶水比不同的条件下对其浸提量的影响。由图3 可知，随着茶水比的增加，多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量均呈先增加后减少的趋势，当茶水比为1∶100 时游离氨基酸、黄酮达到最大值，其中游离氨基酸含量为52.85 mg/g，黄酮含量为58.96 mg/g， 当茶水比大于1∶100 时游离氨基酸及黄酮得率逐渐降低，而当茶水比为1∶125 时，多酚含量达到最大值32.93 mg/g。这可能是由于随着茶水比的增加，核桃花茶中的其他成分也随之溶出，破坏了多酚、黄酮的结构，导致其浸提量有所降低。

图3 茶水比对核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量的影响Fig.3 Effect tea-water ratio on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面设计及试验结果 根据单因素试验结果确定因素水平及范围，以浸提温度、茶水比、浸提时间为响应变量，多酚、黄酮、游离氨基酸浸提量为响应值，进行响应面优化分析，利用Box-Behnken 试验设计原理对因素水平进行编码，结果如表2 所示。

表2 响应面设计及响应值Table 2 Response surface design and response values

2.2.2 模型的建立及其显著性检验 利用Design-Expert 软件对表2 试验数据进行多元回归拟合，得到多酚浸提量Y1、黄酮浸提量Y2和游离氨基酸浸提量Y3对浸提温度A，茶水比B和浸提时间C的二次多项回归模型为：

Y1（mg/g）=40.75+4.74A+0.19B+2.06C+0.045AB+0.84AC+1.52BC-2.99A2-2.60B2-3.90C2

回归结果分析见表3，表4，表5。

表3 核桃花茶多酚浸提回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of polyphenol from walnut staminate flower tea

表4 核桃花茶黄酮浸提回归模型方差分析结果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of flavone from walnut staminate flower tea

表5 核桃花茶游离氨基酸浸提回归模型方差分析结果Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of free amino acids from walnut staminate flower tea

由表3 ～5 可知，温度对多酚、黄酮及游离氨基酸的影响均为极显著；时间对游离氨基酸的影响为显著，对多酚、黄酮的影响较小；茶水比对多酚及黄酮的影响均表现为极显著，对游离氨基酸的影响为显著。通过响应面建立的回归模型可知：多酚浸提模型P＜0.000 4，而黄酮与游离氨基酸浸提模型P＜0.000 1，表明核桃花茶中主要溶出物的浸提回归模型极显著，且其失拟项均不显著，表示核桃花茶中3 种有效成分的拟合度良好，试验误差相对较少，其中多酚的浸提回归模型拟合度为0.961 5，黄酮的浸提回归模型拟合度为0.991 2，游离氨基酸回归模型拟合度0.976 2，因此核桃花茶中的多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量可以用此模型来分析和预测。

2.2.3 响应面分析与条件优化 两变量交互作用的显著性可以用三维响应面图和二维轮廓图来表示，圆形表示变量间交互作用不显著，椭圆形与之相反，响应面图坡度越陡，响应指标对响应因素的变化影响越大［17］。本试验固定不变其他试验因素，考察交互项对浸提效果的影响。由回归方程可绘制核桃花茶多酚、黄酮及游离氨基酸的响应面及等高线图，如图4 ～6 所示。

当浸提时间为40 min 时，由图4 可知，多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量随着浸提温度和茶水比的升高和增加而增加，其中游离氨基酸浸提量在温度95 ℃左右时较为稳定，随着浸提温度的继续升高，浸提量变化不明显，多酚、黄酮的浸提量变化趋势一致，温度越高浸提量越多，但温度超过95 ℃会有降低趋势，这是因为温度太高会导致多酚、黄酮类物质分解，影响浸提效果，而适当的升高温度则可以加剧分子运动，提高浸提得率［18-19］。由图4 中的等高线图可以看出，温度和茶水比对黄酮及游离氨基酸的浸提量交互作用显著，而多酚浸提量随温度上升变化较为缓慢，交互作用不显著。

当茶水比为1∶100（g/mL）时，由图5 可知，多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量随着浸提温度的上升而增加，其中多酚及游离氨基酸浸提量在温度95 ℃ 左右时较为稳定，随着浸提温度的继续升高，浸提量变化不明显，而黄酮浸提量随着浸提温度的升高，浸提量有着微弱的下降趋势，随着浸提时间的延长，在40 min 前浸提量均有着增长的趋势，之后浸提量不会有所增长反而有明显下降趋势，这是因为随着时间的延长，多酚黄酮类化合物达到饱和而受到 空气中氧气的影响，其含量有微弱的下降趋势［20］。由图5 中的等高线图我们可以看出，浸提温度对核桃花茶浸提物的影响较浸提时间更为显著；温度和时间对黄酮浸提量交互作用显著，而对多酚及游离氨基酸交互作用不显著。

图4 核桃花茶浸提过程中温度和茶水比交互作用对浸提量影响的响应面及等高线图Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and water ratio on extraction volume from walnut staminate flower tea

图5 核桃花茶浸提过程中温度和时间交互作用对浸提量影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

当浸提温度为90 ℃时，由图6 可知，多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量随着茶水比的增加而增加，其中游离氨基酸含量在茶水比1∶95 g/mL 左右时保持稳定，随着浸提时间的延长，浸提量变化不明显， 有研究表明茶水比越大，有效成分的浸提率越低，这是由于随着茶水比的增加受茶汤中的其他溶出物影响所致［21］。随着浸提时间的延长，多酚浸提量变化较为明显而黄酮浸提量变化不明显，其中多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量随时间的延长增加之后有着显著的下降趋势，且茶水比的高低与这种趋势无关。

图6 核桃花茶浸提过程中茶水比和时间交互作用对浸提量影响的响应面及等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effect of ter-water ratio and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

由图6 中的等高线图可以看出，浸提时间比茶水比对核桃花茶主要溶出物的影响作用更为显著；多酚浸提量在茶水比1∶90 之前，茶水比较浸提时间影响作用显著，之后则相反，而游离氨基酸与黄酮浸提量受茶水比的影响较显著。

利用 Design-Expert 对核桃花茶中的多酚、黄酮及游离氨基酸的浸提模型进行计算，将响应值重要性设定为同等重要，选取模型最优浸提工艺为：浸提温度96.83 ℃，茶水比1∶99.66 g/mL，浸提时间41.82 min，在此条件下多酚浸提量为42.98 mg/g， 黄酮浸提量为69.28 mg/g，游离氨基酸提取量为67.98 mg/g。

检验所得结果的可靠性，在上述优化后的浸提条件下对核桃花茶进行浸提，结合茶叶冲泡的实际条件，将浸提工艺参数修正为：浸提温度97 ℃，茶水比1∶100 g/mL，浸提时间42 min。在此条件下重复浸提3 次，实际测得多酚浸提量为42.01 mg/g， 黄酮浸提量为68.16 mg/g，游离氨基酸浸提量为67.14 mg/g，与理论预测值相比，多酚的误差率为0.97%，黄酮的误差率为1.12%，游离氨基酸的相对误差为0.84%。因此，基于响应面所得的优化浸提工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，利用响应面法对核桃花茶中的浸提工艺进行了优化，确定了核桃花茶的最优工艺条件为：温度97 ℃、时间42 min、茶水比1∶100 g/mL，在此条件下核桃花茶的主要溶出物多酚、黄酮及游离氨基酸浸提量较高，浸提效果最好，最优工艺条件的实际值与模型预测值相近，验证了模型的可靠性。最佳冲泡条件下浸提的核桃花茶食用价值高，对于核桃雄花及其花茶的进一步研究与开发具有重要意义；此外，可对不同品种核桃花茶的主要溶出物含量进行比对分析，利用数理统计对各品种核桃花茶进行分类；对核桃花茶的品质指标具有一定的检测意义。综上，核桃花茶冲泡工艺的研究可以为消费者及广大研究者提供1种简单、高效的冲泡条件。