联合检测被转化生长因子b 激活的长链非编码RNA和糖链抗原19-9 对胰腺癌的诊断和预后价值

侯巧梅，孟敏

胰腺癌是全球癌症相关死亡的第四大原因。虽然目前对胰腺癌的生物学认识已经取得了实质性的进展，但目前还缺乏有效的筛查工具来检测无症状的癌前病变和早期胰腺癌。此外，胰腺癌由于其深部位置和迟发症状经常导致确诊时已处于晚期，5 年总存活率仅约为5%。因此，迫切需要寻找新的潜在的生物标志物，为准确的预后预测和新疗法的开发提供理论依据。目前，糖链抗原19-9（CA19-9）是诊断胰腺癌的经典指标，对胰腺癌的诊断和预后具有良好的临床价值。治疗后CA19-9 水平升高表明预后不良，治疗反应差。长链非编码RNA（lncRNA）是大于200 个核苷酸的非编码RNA 的子集，其存在于细胞核或细胞质中但不编码蛋白质。虽然大多数lncRNAs 的功能和机制尚不清楚，但先前的证据表明，lncRNA 在基因表达的转录、表观遗传和转录后调节中发挥重要作用。已有学者发现lncRNA 的异常表达与许多疾病相关。最近的一项研究使用lncRNA 微阵列谱发现胰腺癌中的lncRNA 表达在癌组织和癌旁组织间存在显著差异。此外，一些研究表明，lncRNAs 通过调节细胞生长，迁移和侵袭参与胰腺癌的发生发展。然而，关于lncRNA 在胰腺癌中作用的研究仍然十分有限。本研究旨在通过检测胰腺癌病人治疗前血清中被转化生长因子b 激活的长链非编码RNA（lncRNA-ATB）和CA19-9 的水平，探讨lncRNA-ATB 对胰腺癌诊断和预后评估中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012 年4 月至2014 年7 月在安阳市人民医院肝胆外科接受手术治疗的胰腺癌病人作为观察组。纳入标准：（1）病理学确诊为胰腺癌；（2）入组前未接受术前化疗、放疗或靶向治疗。排除标准：（1）合并其他部位肿瘤；（2）合并血液系统疾病或严重肝肾功能疾病。共有103例病人纳入观察组。其中男性68例、女性35 例；年龄范围为40～75 岁，年龄（58.46±7.93）岁；胰头癌66 例，胰腺体尾部癌37 例；肿瘤长径＜2 cm 者32 例，2～4 cm者58 例，＞4 cm 13 例。同时选取同时期住院的胰腺良性疾病病人150 例作为良性组，其中急性胰腺炎病人49例、慢性胰腺炎病人71例、胰腺良性占位病人30 例；男性105 例、女性45 例；年龄范围为40～75 岁，年龄（57.88±8.04）岁。选取同时期健康体检者150 例作为对照组，其中男性100 例、女性50 例；年龄范围为45～65岁，年龄（57.13±6.35）岁。三组人群性别构成和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有病人都提供了书面知情同意书。

1.2 血清lncRNA-ATB 和CA19-9 水平检测

抽取观察组和良性组病人治疗前、健康组体检当日清晨空腹静脉血4 mL，3 000 r∕min 离心取上清液。采用电化学发光法（雅培I2000 化学发光仪）检测血清CA19-9，正常参考值范围＜39 U∕mL。采用TRIzol试剂盒（Invitogen，Carlsbad，CA，USA）提取总RNA。使用转录子第一链cDNA 合成试剂盒（德国罗氏）将总RNA（1 μg）用序列特异性引物或锚定寡聚（dT）18 引物和随机六聚体引物逆转录成互补cDNA。采用实时定量PCR（qRT-PCR），以β-肌动蛋白水平作为正常化对照检测lncRNA-ATB 的相对表达量。引物序列见表1。反应条件如下：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火，延伸1 min，40 个循环。用2法计算lncRNA-ATB 的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 治疗方法和随访

良性组病人接受常规治疗。观察组接受手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗方式者27例，接受术后化疗者36例，接受术后放疗联合化疗者40 例。采用电话结合门诊复诊的方式进行随访，随访间隔为每3 个月随访1 次。随访截止日期为2019 年8 月1 日，失访7 例。总体生存时间为第一次手术到胰腺癌相关死亡的时间（未发生死亡时间者为最后一次随访时间）。

2 结果

2.1 一般资料比较

三组研究对象血清天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和空腹血糖（GLU）均差异有统计学意义（均P＜0.01），而三酰甘油（TG）和总胆固醇（TC）差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 三组研究对象血清CA19-9及lncRNA-ATB比较

观察组lncRNA-ATB和CA19-9水平均显著高于良性组和健康组（均P＜0.05），良性组lncRNA-ATB和CA19-9水平显著高于健康组（P＜0.05）。见表3。

表2 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康体检者150例一般资料比较

表3 胰腺癌103例、胰腺良性疾病150例及健康体检者150例血清CA19-9及lncRNA-ATB比较

2.3 血清

lncRNA-ATB

水平对胰腺癌的诊断效能

ROC曲线显示，血清lncRNA-ATB、CA19-9以及两者联合的曲线下面积（AUC）分别为0.833（95%CI：0.793～0.868，P＜0.001）、0.765（95%CI：0.720～0.805，P＜0.001）、0.884（95%CI：0.849～0.914，P＜0.001）。其中，两者联合检测与lncRNA-ATB 及CA19-9 的AUC差异有统计学意义（P＜0.05）。lncRNA-ATB与CA19-9 的AUC 差异有统计学意义（P＜0.05）。当lncRNA-ATB 截断值为2.85 时，lncRNA-ATB 胰腺癌的灵敏度为74.8%，特异性为79.0%。当CA19-9 截断值为94.04 U∕mL时，CA19-9诊断胰腺癌的灵敏度为39.8%，特异性为99.3%；而两者联合检测的敏感性为79.6%，特异性84.7%。见图1。

图1 血清lncRNA-ATB、CA19-9以及两者联合检测诊断胰腺癌96例的ROC曲线（失访7例）

2.4 血清lncRNA-ATB 与CA19-9的相关性分析

Pearson 相关分析显示，lncRNA-ATB 与CA19-9呈显著正相关（r＝0.307，P＜0.001）。见图2。

2.5 血清lncRNA-ATB及CA19-9与胰腺癌病人预后的相关性分析

年龄、淋巴结转移、TNM分期、血清lncRNA-ATB 相对表达量及血清CA19-9 纳入COX 回归模型，结果发现高龄、淋巴结转移、较高TNM 分期、较高血清lncRNA-ATB 相对表达量及较高血清CA19-9 是影响胰腺癌病人术后生存的独立危险因素。见表4及图3。

图2 胰腺癌103例中病人血清lncRNA-ATB与CA19-9的相关性分析

表4 胰腺癌96例多因素生存分析

图3 血清lncRNA-ATB相对表达量与胰腺癌96例总体生存率的相关性（失访7例）

3 讨论

胰腺癌是全球最常见和最致命的癌症之一。因此，寻找新的分子靶点对于胰腺癌的诊断、预后和治疗具有重要意义。随着基因组测序技术的发展，人们普遍认为只有不到2%的人类基因编码蛋白质，剩下的98%编码非编码RNA（ncRNAs）。ncRNAs 包括lncRNAs 和环状RNAs，最初被认为是转录的“噪音”或身体的“暗物质”。近年来，越来越多的研究表明，lncRNAs在多种疾病，特别是恶性肿瘤中发挥着重要作用。

lncRNA-ATB 是位于chr14（q11.2）上的poly（A）-阴性的RNA。有研究发现lncRNA-ATB 在肝细胞癌中表达上调并且与预后不良相关。此外，也有学者发现lncRNA-ATB 是胃癌的独立预后标志物，参与结直肠癌的进展和预后。同样Shi等表明lncRNA-ATB 在乳腺癌病人的曲妥珠单抗耐药SKBR-3细胞和曲妥珠单抗耐药组织中显著上调，并且可以促进曲妥珠单抗耐药和乳腺癌中的侵袭-转移级联反应。然而，关于lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中诊断和预后中的作用知之甚少。本研究发现，血清lncRNA-ATB 在健康对照者、良性疾病病人和胰腺癌病人中表达逐渐增高，表明血清lncRNA-ATB可能是胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。ROC曲线分析显示，当lncRNA-ATB 的截断值为2.85，CA19-9 的截断值为94.04 U∕mL 时，血清lncRNAATB、CA19-9以及两者联合诊断胰腺癌的AUC分别为0.833、0.765、0.884。与CA19-9 相比，血清lncRNA-ATB 诊断胰腺癌的AUC 显著增加，表明血清lncRNA-ATB对胰腺癌的诊断价值优于CA19-9。进一步分析两者联合检测对胰腺癌的诊断价值，发现联合检测可提高胰腺癌诊断的灵敏度和特异性，有助于提高诊断的准确性。

已有研究证实lncRNA-ATB 表达上调的结直肠病人预后更差。Jang 等发现，lncRNA-ATB 表达上调是影响肝细胞癌病人术后生存的独立危险因素。此外，lncRNA-ATB 在胃癌组织中的表达高于正常组织，其表达水平与胃癌病人术后总生存率显著相关。这些证据提示lncRNA-ATB可能在胰腺癌预后判断中具有一定的价值。本研究发现，血清lncRNA-ATB表达上调的胰腺癌病人生存时间明显缩短，与在其他肿瘤中的研究结果一致。

目前，lncRNA-ATB 参与胰腺癌发生发展的机制尚不完全清晰。Sun 等研究发现，相较于癌旁组织，胰腺癌组织的lncRNA-ATB 相对表达量下降。我们的研究则表明，胰腺癌病人lncRNA-ATB表达水平均显著高于良性组和健康组。值得说明的是，与文献报道相比，癌组织中lncRNA-ATB 表达水平仍要高于外周血表达水平，这可能是导致其释放到循环的lncRNA-ATB 量还是要高于正常人的原因之一。此外，考虑到血液学生物标志物的变异性，重复测量可能提供更为精确的lncRNA-ATB相对表达量。

综上所述，本研究发现血清lncRNA-ATB 在胰腺癌病人中表达显著上调，是胰腺癌早期诊断和预后评估的潜在生物标志物。