微小RNA-9-5p 调控脂多糖诱导小鼠树突状细胞免疫功能的机制研究

段晓星，常永丽，张丽英，米建强

肾炎是一种多种因素引起的肾功能减退的肾脏疾病，严重者会在终末期发生肾功能不全或尿毒症，还可并发一系列免疫系统疾病（糖尿病、红斑狼疮、过敏性紫癜），严重影响病人的健康和安全。因此，寻找高效的治疗药物对病人的预后具有重要意义。微小RNA（miRNA）是一种18-25个核苷酸组成的内源性短链非编码的微小RNA分子，其通过抑制靶基因的转录或翻译过程，参与基因的功能调控，进而在人类的各种疾病的发生发展中发挥作用。微小RNA-9-5p（miR-9-5p）在人类的癌症、神经退行性疾病和免疫系统疾病中均具有调控作用，甚至也有研究报道，其可调控人类树突状细胞的功能。树突状细胞（DCs）是一种功能最强的专职抗原提呈细胞（APC），其对抗原进行捕获、加工，处理后提呈给主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ、Ⅱ类分子，诱导活性T、B淋巴细胞的增殖，在调节特异性免疫反应中起决定性作用。信号转导和转录激活因子6（STAT6）为信号转导和转录激活因子（STAT）家族的成员之一，有研究报道，其在树突状细胞的功能中具有重要作用。但是，miR-9-5p 对肾炎树突状细胞免疫功能的影响是否与STAT6 存在相关性尚且未知。2019 年1—9 月笔者以脂多糖（LPS）诱导的小鼠树突状细胞DC2.4 为研究对象，检测其中miR-9-5p、STAT6 的表达，观察过表达miR-9-5p、敲减STAT6对LPS诱导的DC2.4细胞的免疫功能的影响，揭示其机制与miR-9-5p 靶向STAT6 具有相关性，为肾炎的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠树突状细胞DC2.4购自ATCC；RPMI1640 培养基购自Gibco；MTT 购自上海威奥生物科技有限公司；白细胞介素-6（IL-6）检测试剂盒、肿瘤坏死因子α（TNF-α）检测试剂盒均购自碧云天；胎牛血清购自杭州四季青；RNA 抽提试剂盒、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自大连Takara；兔抗人STAT6 多克隆抗体购自LSBio；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体购自美国Santa；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分离培养 用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养小鼠树突状细胞DC2.4，将其置于37 ℃，5% 二氧化碳的培养箱中常规培养、传代。用 含 有5 μg∕mL 的LPS 的 完 全 培 养 基 处 理DC2.4 细胞48 h，标记为肾炎树突状细胞（Nephritis DCs）组。

1.2.2 细胞转染与分组 为了揭示肾炎小鼠树突状细胞中miR-9-5p、STAT6的表达存在差异，将正常培养的小鼠树突状细胞DC2.4、LPS诱导的DC2.4细胞分别标记为Normal DCs组、Nephritis DCs组；为探究miR-9-5p、STAT6 对肾炎小鼠树突状细胞免疫功能的影响，将Blank组（未做任何处理）、miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-9-5p 模拟物（mimics）、miRNA抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-9-5p抑制剂（anti-miR-9-5p）、小干扰RNA无序对照（si-NC）组、STAT6 小干扰RNA（si-STAT6）、miR-9-5p mimics+空载体质粒（pcDNA）、miR-9-5p mimics+STAT6过表达质粒（pcDNA-STAT6），按照脂质体Lipofectamine2000 的说明书操作步骤转染至Nephritis DCs 细胞，依次记为miR-NC 组、miR-9-5p 组、antimiR-NC组、anti-miR-9-5p组、si-NC组、si-STAT6组、miR-9-5p+pcDNA 组、miR-9-5p+pcDNA-STAT6 组，转染8 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，用qRTPCR 法检测转染效率，转染成功后，用于后续的实验研究。

1.2.3 MTT 法检测细胞的增殖 将Normal DCs 组、Nephritis DCs 组细胞分别培养24、48、72 h，将其调整为10个∕毫升，取100 μL 细胞至96 孔板，再加入20 μL 5 g∕L 的MTT 溶液培养3 h，然后再加入50 μL二甲基亚砜（DMSO）进行震荡，以完全溶解结晶紫。在490 nm波长下检测细胞吸光度（A）。

1.2.4 ELISA 实验检测细胞中IL-6、TNF-α 的含量收集対数増殖期细胞，用12 000 r∕min 离心，取上清进行样本中炎性因子IL-6、TNF-α 的检测。检测步骤按照IL-6 检测试剂盒、TNF-α 检测试剂盒的操作步骤要求进行，最后再450 nm 波长下读取数据，按照试剂盒评判标准和结果计算方法计算样本中IL-6、TNF-α的含量。

1.2.5 qRT-PCR 法检测细胞中miR-9-5p、STAT6、CD80、CD86、IL-12的mRNA表达 取适量对数生长期“1.2.2”各组细胞，按RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量，然后按反转录试剂盒按照说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行miR-29c检测。以U6、GAPDH作为内参，用2法计算miR-9-5p、STAT6、白细胞分化抗原80（CD80）、白细胞分化抗原86（CD86）、白细胞介素-12（IL-12）的相对表达。

引物信息（5’-3’）：miR-9-5p正向引物GGGTCTTTGGTTATCTAGC，反向引物TGCGTGTCGTGGAGTC；U6 正向引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3；CD80正向引物AATTGTTGGCTTTCACTTT，反向引物AGCGTCTTTTTCATACTTCA；CD86 正向引物GGACAAGGGCTTGTATCAA，反向引物ATTGCTCGTAACATCAGGGA；IL-12正向引物GTTCCCATGCCTTCACCACT，反向引物CCGGTTCTTCAAGGGAGGAT；GAPDH 正向引物GTCAGCCGCATCTTCTTTTG，反向引物GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.2.6 蛋白质印迹法检测细胞中STAT6 的蛋白表达 收集细胞，并用RIPA 裂解液裂解，提取细胞总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。各组蛋白进行上样、SDS-PAGE 后，经电转将蛋白转移至PVDF 膜上。用2.5%脱脂牛奶室温封闭90 min，加入一抗（兔抗人STAT6多克隆抗体1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBS 洗涤3 次，每次5 min；再加入相对应的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体1∶500）室温孵育2 h，PBS 洗涤3 次，每次10 min，后在暗室中曝光、显影、定影，最后用Quantity One凝胶分析软件测定各组蛋白条带的吸光度，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测细胞的荧光活性将STAT6 3’UTR-WT（含STAT6 3’UTR 片段）和STAT6 3’UTR-MUT（含STAT6 3’UTR 突变体片段）的荧光素酶报告载体，采用Lipofectamine2000 分别与miR-9-5p、miR-NC、anti-miR-9-5p、anti-miR-NC共转染，24 h后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，记录萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，以两者的比值评价细胞的荧光活性。

2 结果

2.1 肾炎小鼠树突状细胞模型的建立

结果如表1所示，与Normal DCs组相比，Nephritis DCs组细胞在48、72 h时，细胞活力降低，炎性因子IL-6、TNF-α的含量均升高（P＜0.05）。

表1 肾炎小鼠树突状细胞的增殖和炎性因子IL-6、TNF-α的分泌∕

2.2 肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能

结果如表2所示，与Normal DCs组相比，Nephritis DCs组细胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表达均降低（P＜0.05）。

表2 肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能∕

2.3 miR-9-5p、STAT6 在肾炎小鼠树突状细胞中的表达

结果如图1 和表3 所示，与Normal DCs 组相比，Nephritis DCs 组细胞中miR-9-5p 的mRNA 表达降低，STAT6 的mRNA 和蛋白表达均升高（P＜0.05）。

图1 STAT6在肾炎小鼠树突状细胞中的蛋白表达

表3 miR-9-5p、STAT6在肾炎小鼠树突状细胞中的表达∕

2.4 过表达miR-9-5p抑制肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能

结果如表4所示，与miR-NC组相比，miR-9-5p 组细胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表达均降低（P＜0.05）。

表4 过表达miR-9-5p抑制肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能∕

2.5 miR-9-5p靶向STAT6

通过生物信息学在线预测网站Target Scan（http：∕∕www.targetscan.org∕）预测到miR-9-5p 与STAT6 的3’端存在6 个互补的结合位点（图2A）。双荧光素酶报告基因检测实验结果显示，与miR-NC 组相比，miR-9-5p 组WT-STAT6细胞的荧光活性降低，MUT-STAT6细胞的荧光活性不受影响，与anti-miR-NC 组相比，anti-miR-9-5p 组WT-STAT6 细胞的荧光活性升高，MUT-STAT6 细胞的荧光活性变化不。与miR-NC 组相比，miR-9-5p组细胞中STAT6的mRNA和蛋白表达均降低，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组细胞中STAT6的mRNA和蛋白表达均升高（P＜0.05），见表5。

表5 miR-9-5p靶向负调控STAT6表达∕

2.6 敲减STAT6抑制肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能

结果如表6 所示，与si-NC 组相比，si-STAT6组细胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表达均降低（P＜0.05）。

2.7 过表达STAT6逆转了miR-9-5p对LPS诱导的小鼠树突状细胞免疫功能的抑制作用

结果如表7 所示，与miR-9-5p+pcDNA 组相比，miR-9-5p+pcDNA-STAT6组细胞中miR-9-5p表达降低，CD80、CD86、IL-12的mRNA的表达均升高（P＜0.05）。

3 讨论

图2 miR-9-5p与STAT6之间存在互补的结合位点和STAT6的蛋白表达：A为miR-9-5p与STAT6之间存在互补的结合位点；B为STAT6的蛋白表达

表6 敲减STAT6抑制肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能∕

表7 过表达STAT6逆转了miR-9-5p对肾炎小鼠树突状细胞免疫功能的抑制作用∕

不同的细胞类型构成了一个称为树突状细胞（DCs）的群体，它调节先天免疫和适应性免疫之间的平衡。基本上，树突状细胞调节T 淋巴细胞激活或抑制体内的特定免疫反应。新的医学治疗策略旨在利用DCs功能来恢复机体的稳态。耐受性树突状细胞（tDCs）在不激活T细胞的情况下保持抗原呈递的稳定状态。在细胞与细胞的相互作用中，tDCs将幼稚T 细胞转化为调节性T 淋巴细胞，诱导自身反应性T细胞失去功能，自然发生的T调节性T淋巴细胞和T 细胞抑制性淋巴细胞的扩增。因此，tDCs 可用于自身免疫性疾病或移植排斥治疗。微小RNA（miRNA）在转录后基因表达调控中的作用得到越来越多的认可。Zuzana 等在树突状细胞的研究中报道，在人类未成熟树突状细胞（iDC）、活化树突状细胞（aDCs）和耐受tDC中，miR-9在活化成熟的DCs 细胞中的表达异常升高，但是其在耐受的DCs 细胞中的表达异常降低，提示了miR-9 在树突状细胞的功能发挥张具有潜在的调控作用。于是，我们猜测miR-9-5p可能在肾炎小鼠树突状细胞的免疫功能中具有一定的调控作用。本研究首先用LPS 诱导DC2.4细胞损伤建立小鼠树突状细胞炎性损伤模型，发现模型细胞中CD80、CD86、IL-12表达明显下调，再通过qRT-PCR法检测其中miR-9-5p的表达水平发现，miR-9-5p 在受损的DC2.4 细胞中的表达异常降低；进一步研究发现，过表达miR-9-5p可抑制DC2.4 细胞中CD80、CD86、IL-12 的表达水平，抑制DC2.4细胞的免疫功能；深入研究，通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测实验、qRT-PCR实验和蛋白质印迹法验证了miR-9-5p靶向STAT6，并且负向调控STAT6 的表达水平。这些实验结果揭示了miR-9-5p可抑制受损的DC2.4细胞的免疫功能，提示，miR-9-5p对炎性损伤的DC2.4细胞的免疫功能的调控可能与STAT6具有一定的相关性。

STAT6 是IL-4 受体反向的主要转录因子，其在巨噬细胞活化、T 细胞分化、嗜酸性粒细胞、上皮细胞的功能表达中均具有调控作用。有很多研究报道，STAT6 也参与树突状细胞的功能表达。Szanto 等发现，STAT6 在过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）信号调控树突状细胞的脂质代谢和炎症反应中具有重要的促进作用。Quan 等报道，精氨酸酶1（Arg1）可刺激DCs 细胞的分化，其机制与Arg1 启动子内的新型STAT6 结合位点介导STAT6 和组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）的调节相关，揭示了HDAC4 和STAT6 之间的联合作用是DC中Arg1转录的重要调节机制。由此可见，STAT6在DCs的分化、脂质代谢、炎症等功能中具有重要调控作用，但是其对DCs 细胞的免疫功能的影响及正向调控机制尚未十分清楚。本研究通过qRT-PCR、蛋白质印迹法检测了LPS 诱导的DC2.4 细胞中STAT6的表达发现，STAT6 表达水平异常升高，并且敲减STAT6 可 抑 制LPS 诱 导 的DC2.4 细 胞 中CD80、CD86、IL-12的表达，抑制DC2.4细胞的免疫功能，这些实验结果说明STAT6 有助于增强树突状细胞的免疫功能。有趣的是，我们还发现过表达STAT6逆转了miR-9-5p对LPS诱导的小鼠树突状细胞免疫功能的抑制作用，这说明了STAT6 也可逆向负调控miR-9-5p在LPS诱导的DC2.4细胞中的表达和免疫抑制功能。这些实验结果为miR-9-5p、STAT6 用于包括肾炎在内的炎性疾病的免疫治疗提供了理论参考。

综上所述，miR-9-5p可抑制脂多糖诱导的小鼠树突状细胞的免疫功能，其机制可能与靶向STAT6相关，为炎症的基因治疗提供新的理论依据。