氧化银钛纳米管治疗骨关节假体相关性感染的实验研究

王成贵，李宣明

人工关节置换术能达到缓解关节疼痛，恢复关节功能的目的。生物材料相关感染是医疗植入物最严重的术后并发症之一，导致病人痛苦，经济负担甚至死亡。感染可能是由于术前不完全消毒，外科手术过程中的非标准方案，或手术后细菌从感染的，邻近的组织和血源传递到植入物表面。在细菌到达植入物表面后，它们将聚集在由它们自身分泌的细胞外粘性多糖中以形成生物膜。生物膜使细菌对宿主防御和抗菌剂具有高度抗性，从而导致持续和慢性感染。纳米材料可以有效地提高生物材料的生物学性能。Ag 纳米颗粒（Nanoparticle，NPS）或盐目前用于各种医疗材料和设备中以预防感染，例如伤口敷料、烧伤软膏、导管、血管移植物和骨骼固定装置。氧化银钛纳米管（AgO-TiO-NTS）不是将Ag加载到所形成的TiONTS中，而是采用在Ti上沉积TiAg 涂层然后进行阳极氧化的策略来制造负载Ag 的TiONTS。AgO-TiO-NTS 具有嵌入无定形二氧化钛纳米管壁中的结晶AgO NP的独特结构，并且由于二氧化钛产生的屏障效应，NT-AgO阵列显示出较慢的Ag释放。本研究通过体内外实验，探讨装载了AgO-TiO-NTS 在治疗骨关节假体相关性感染过程中，对表面葡萄球菌及金黄色葡萄球菌的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 一般材料

2018 年5 月至2019 年5 月使用健康新西兰大白兔32只［由河北大学医学院实验动物中心提供。动物许可证号：SYXK（冀）2017-002］，建立人工关节置换术后感染模型，并随机分为表-Ag钉组（使用AgO-TiO-NTS 复合涂层的螺钉，拆线后1 d，兔术侧膝关节注入表皮葡萄球菌悬液，n＝8）、表-普钉组（使用没有涂层的普通螺钉，拆线后1 d，兔术侧膝关节注入表皮葡萄球菌悬液，n＝8）、金-Ag钉组（使用AgO-TiO-NTS 复合涂层的螺钉，拆线后1 d，兔术侧膝关节注入金黄色葡萄球菌悬液，n＝8）、金-普钉组（使用没有涂层的普通螺钉，拆线后1 d，兔术侧膝关节注入金黄色葡萄球菌悬液，n＝8）。每组各4 只雄性和4 只雌性，以避免因性激素而产生的性别偏见和不同结果。所有实验程序均经动物保护和使用委员会批准的方案下进行，根据实验动物护理和使用指南进行实验。

1.2 人工膝关节置换大白兔模型

以20%乌拉坦（3 mL∕kg）进行麻醉，在左侧髌骨外侧0.5 cm处作一长约6～8 cm的纵行切口，将髌骨向外翻开，切除半月板及前交叉韧带，保留后交叉韧带。屈膝90°，扩髓，股骨髁和胫骨平台各截骨2 mm。根据髓腔及骨床的大小选取合适的人工膝关节假体并复位。

1.3 方法

1.3.1 AgO-TiO-NTS 将纯Ti 棒切成薄片（F14 mm×2 mm）并用作基材。将样品抛光至镜面上，然后分别在丙酮，乙醇和去离子水中依次超声清洗5 min，并在引入沉积室之前在空气中干燥。通过脉冲DC 磁控溅射在室温下用TiAg 靶将TiAg 涂层沉积在Ti 上。在沉积之前，将基板在～800 V 的偏压，40%的占空比，60 kHz 的脉冲频率和5.0 Pa 的工作压力下溅射清洗30 min。然后，在300 的目标功率下进行TiAg 涂层的沉积，脉冲频率为60 kHz，工作压力为0.8 Pa，沉积时间为3 h。对沉积的Ti-Ag 涂层进行电化学阳极氧化，以产生AgO-TiO-NTS，如图1 所示。使用含有0.3%的乙二醇溶液作为电解质。阳极氧化在室温下以30 V 的恒定DC电势在具有铂（Pt）箔对电极的双电极设置上进行4 h。在阳极氧化之后，立即用去离子水洗涤样品并超声清洗以除去残留的电解质以及表面氧化物层。

图1 抗菌涂层钛纳米管Ag2O-TiO2-NTS制备示意图

1.3.2 人工膝关节制备 兔的人工膝关节是仿生关节，基于兔膝关节的解剖形态和生物动力学特点，设计并且用钛合金（Ti6Al4V，中国有色金属研究所，中国）制造。兔的人工膝关节由股骨髁假体和胫骨平台假体及与其相连的髓内延长杆组成，关节面抛光。

1.3.3 抗菌测定 通过平板计数法评估AgO-TiO-NTS对革兰阳性表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性。将细菌在牛肉提取物-蛋白胨（BEP）培养基中在搅拌下培养18 h，（37.0±0.5）℃。用BEP 稀释至浓度为1.0×10CFU∕mL，将50 mL 细菌悬浮液加入每个样品表面，共分为四组：1 mmol∕L组、2 mmol∕L 组、5 mmol∕L 组和10 mmol∕L 组。并将具有细菌悬浮液的样品在（37.0±0.5）℃下在相对湿度＞90%的黑暗中温育12 h。在孵育期结束时，将每个样品在PBS中冲洗并超声搅拌以从样品中分离细菌。PBS中的活细菌通过标准连续稀释和平板计数来定量。将样品灭菌，超声清洗，并在（37.0±0.5）℃下在10 mL PBS 中孵育6.5 d，每天更换PBS。使用细菌培养测定重新研究样品。14 d 的抗菌活性：R＝（B-A）∕B×100%其中R是抗菌速率，B和A分别是TiONT（对照）和不同浓度AgO-TiO-NTS（样品）上的活细菌（CFU）的平均数。

1.3.4 细胞培养及细胞毒性和细胞增殖 新西兰大白兔膝关节软骨细胞用于AgO-TiO-NTS 的生物学测定。将细胞在补充有10%小牛血清（CBS），100 U∕mL青霉素和100 mg∕mL链霉素的α-MEM中，在37 ℃，5%二氧化碳的湿润气氛中培养。当达到亚干扰时，通过温和胰蛋白酶消化收获细胞，离心，重悬于完全培养基中并重新接种。为了评估细胞增殖，细胞毒性和形态，将膝关节软骨细胞以2×10个细胞∕cm的密度接种在样品上。通过用于哺乳动物细胞的LIVE∕DEADO 活力∕细胞毒性试剂盒测定样品的细胞毒性。通过MTT 方法定量评估细胞增殖和活力。在酶标仪（In fi nite F50，TECAN）上在570 nm和600 nm下测量吸光度。

1.3.5 白细胞计数、C反应蛋白（CRP）水平、降钙素原（PCT）水平和红细胞沉降率（ESR） 假体周围感染通常会导致感染典型的实验室检查发生变化。指南建议确定CRP、PCT 水平和ESR。使用市售试剂盒细胞内PCT 和CRP 活性。THME-ESR2040 动态血沉分析仪检测ESR，所有检测均按仪器及试剂说明书规范操作。

2 结果

2.1 不同浓度的AgO-TiO-NTS 溶液菌落数及抗菌率比较

仅1 mmol∕L 和2 mmol∕L 两组P＞0.05，其余5 mmol∕L 组和10 mmol∕L 组两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着AgO-TiO-NTS溶液浓度的增加，抗菌率逐渐增加，10 mmol∕L AgO-TiO-NTS 溶液抗菌效果最强（32.34±1.75）CFU，故以10 mmol∕L Ag2O-TiO2-NTS 溶液制作表-Ag 钉组及金-Ag钉组的复合涂层并用于实验（表1）。

表1 Ag2O-TiO2-NTS不同处理的新西兰大白兔膝关节软骨细胞培养菌落数和抗菌率统计

2.2 细胞毒性和细胞增殖

使用LIVE ∕DEADO 活力∕细胞毒性试剂盒定性测定Ag 钉的细胞毒性，结果显示，表-Ag钉组、表-普钉组及金-Ag钉组和金-普钉组细胞死亡数目和细胞增殖数目差异无统计学意义（P＞0.05），说明AgO-TiO-NTS 没有毒性且不影响细胞增殖，安全可靠。见表2。

表2 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只膝关节软骨细胞毒性和细胞增殖∕（CFU，）

表3 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只肛温水平比较∕（℃，）

表4 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只C反应蛋白（CPR）水平比较∕（mg∕L，）

表5 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只红细胞沉降率（ESR）水平比较∕（mm∕h，）

表6 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只降钙素原（PCT）水平比较∕（μg∕L，）

2.3 各组肛温、CRP、ESR、PCT 水平比较

金-普钉组肛温注射后10 d 最高（41.94±0.87）℃；金-普钉组CRP 注射后14 d 最高（91.95±6.47）mg∕L；金-普钉组ESR 注射后14 d 最高（70.13±4.47）mg∕L；金-普钉组PCT 注射后14 d 最高（2.58±0.54）μg∕L，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3～6。

2.4 不同处理组并发症发生率和死亡率

表-Ag钉组与表-普钉组比较及金-Ag钉组与金-普钉组比较，并发症发生率和死亡率，差异有统计学意义（P＜0.05），如表7所示。

表7 不同方法处理人工膝关节置换模型兔32只并发症发生率和病死率比较∕%

3 讨论

人工关节置换术后的并发症对病人和治疗它们的医生构成了重大挑战。例如，原发性膝关节置换术后的并发症发生率为2%～10%。其中围手术期关节假体周围感染是第三大常见并发症。根据最近的研究，初次全髋关节置换术的假体周围感染的平均发生率为0.2%～2%。对于二次手术，它可以高达5%。关于感染发生率的数据根据人工关节的位置和类型（臀部＜1%，膝关节＜2%，肘＜9%，肩关节＜1%，巨型内置假体∕肿瘤内假体15%）和病人依赖因素而变化。假体周围关节感染是人工关节二次手术的最常见原因之一（髋部15%，膝关节25%）。危险因素可分为以下几组：病人依赖因素（如体质量过重，糖尿病，尼古丁∕酒精∕药物滥用，营养不良），手术依赖因素（如手术时间延长），植入依赖因素（如巨型-假体），所有这些都增加了假体周围关节感染的风险。引起假体周围关节感染的最常见病原体是表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，链球菌，肠球菌和革兰阴性菌。病原体可能在手术期间或之后进入关节，或者它们可以从相邻的感染部位连续扩散到关节。

感染预防除了术前风险评估和风险最小化之外，感染预防包括快速，适当的手术，最大限度地减少手术风险，以及具有足够经验的手术团队。治疗优化可以降低长期成本并降低病人的风险。本研究中，AgO-TiO-NTS材料显示较慢的Ag释放，因为被TiO屏障包围，从而减少Ag释放引起的细胞毒性。我们的工艺沿着NT 的整个长度产生均匀分布的Ag NP，并且可以在一定范围内调节掺入的Ag的量。AgO-TiO-NTS显示出良好的抗菌特性和细胞相容性，并且在预防植入物相关感染方面具有良好效果。而且，NT-AgO阵列的制造工艺简单，经济且通用。尽管与其他的研究报道相比，AgO-TiO-NTS 中的Ag释放显著减少，但是AgO-TiO-NTS的长期抗菌能力仍能得到很好的维持。有人提出Ag的抗菌活性主要是释放的Agb，它诱导细菌蛋白的失活，DNA的缩合和细菌细胞膜的降解。此外，据报道，Ag NPS与细菌之间的直接接触会诱导质膜的结构变化和功能损伤，从而导致细胞溶质渗漏和细菌溶解。因此，AgO-TiO-NTS的抗菌活性源于释放的Ag与Ag NP 直接接触的协同作用。鉴于两种抗菌机制，AgO-TiO-NTS可在植入物表面上产生持续的抗菌环境。应该注意的是，与其他研究相比，尽管在我们的抗菌测定中样品表面引入的细菌较少，但实验条件仍然比体内正常情况更为严酷。预计AgO-TiO-NTS 可以防止感染发生的有效时间比本研究证明的14 d更长。

确定AgO-TiO-NTS 是否具有良好的细胞相容性是有意义的。在我们的实验中，从所有AgO-TiO-NTS 释放的Ag的量远低于所有普遍接受的人体细胞毒性浓度阈值。正如细胞实验所证明的，AgOTiO-NTS对细胞的增殖和活力没有明显的有害影响。

综上所述，AgO-TiO-NTS 通过TiAg 涂层的磁控溅射和阳极氧化产生。该材料由嵌入无定形TiO纳米管壁中的结晶AgO NP 组成。AgO-TiO-NTS在体内外均对表面葡萄球菌及金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌作用，在治疗骨关节假体相关性感染有良好前景。该技术可以扩展到其他功能性涂层和生物材料。