α-硫辛酸对白细胞介素1β 诱导的软骨细胞损伤的保护作用

邓慧琳，杨婧，郭俐

类风湿关节炎（RA）影响全球约1%的人口健康，是世界各国普遍关注的健康问题和经济问题。研究显示，α-硫辛酸在白细胞介素1β（IL-1β）诱导的软骨细胞模型中发挥抗炎作用，对骨关节炎软骨细胞损伤具有保护作用，但其作用机制尚未完全阐明。近年来，微小RNA（miRNA）因其广泛参与增殖、凋亡、炎症和免疫等生物学和生物学过程而受到广泛关注。例如，在Ⅱ型胶原诱导的RA 大鼠模型中，微小RNA-26a（miR-26a）的表达下调，上调miR-26a 可以减轻软骨损伤，刺激细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡；微小RNA-23a（miR-23a）通过抑制核因子κB 激酶抑制剂（IKKα）表达抑制RA 软骨细胞的炎症反应。微小RNA-877-5p（miR-877-5p）是miRNA 家族成员之一，研究发现，在阿司匹林所致的人胃黏膜上皮细胞损伤中miR-877-5p 表达上调，抑制miR-877-5p 表达能够减轻阿司匹林所致胃黏膜上皮细胞损伤。N-myc下游调节基因2（NDRG2）隶属于NDRG 基因家族的成员，与骨发育密切相关。研究发现，TNF-α刺激人类风湿性关节炎滑膜细胞可降低细胞中NDRG2 的蛋白水平。生物信息学分析显示，NDRG2 是miR-877 的潜在靶基因，但α-硫辛酸和miR-877-5p 对IL-1β 诱导的软骨细胞损伤的影响，以及α-硫辛酸能否通过调控miR-877∕NDRG2 表达影响IL-1β 诱导的软骨细胞损伤目前还尚未可知。因此，本研究以IL-1β 诱导的软骨细胞模拟RA 软骨细胞损伤模型，分析α-硫辛酸对IL-1β 诱导的软骨细胞损伤的影响，初步探索其可能的分子机制，以期为α-硫辛酸在RA 的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

本研究于2019 年1 月至2019 年7月在南充市中心医院风湿免疫科实验室完成。8只（4周龄）SPF级雄性SD大鼠购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司；IL-1β 购自美国Sigma 公司；α-硫辛酸（CAS 号：1077-28-7；纯度：BR，99%）购于上海源叶生物技术有限公司；杜尔伯格氏伊戈尔培养基（DMEM）和胎牛血清购于hyclone 公司；聚合酶链式反应（PCR）引物、miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-877 模拟物（mimics）、miRNA 抑制物阴性对照（anti-miR-NC）、miR-877 抑制物（anti-miR-877）、NDRG2 野生型荧光素酶报告载体（WT-NDRG2）和NDRG2突变型荧光素酶报告载体（MUT-NDRG2）的构建和测序由北京华大基因公司提供；Trizol 试剂、放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液、蛋白质印迹（Western）封闭液、洗涤液均购于上海碧云天公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）∕碘化丙啶（PI）试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和干扰素γ（IFN-γ）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购于武汉艾美捷科技有限公司；兔源B 细胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）单克隆抗体、兔源Bcl相关X蛋白（Bax）多克隆抗体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔Ⅱ抗购于Abcam 公司；鼠源NDRG2 单克隆抗体和HRP 标记的羊抗鼠Ⅱ抗购于Santa Cruz公司。

1.2 大鼠膝关节软骨细胞分离及培养

取8只SPF级SD 大鼠，麻醉处死后，无菌条件刮取膝关节关节软骨，经2 g∕L的Ⅱ型胶原酶消化处理4 h，分离软骨细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行体外培养。

1.3 细胞分组和处理

将同一批次生长良好的第二代关节软骨细胞以2×10个∕孔接种到6 孔板，采用随机数字表随机分为Con 组（正常培养的软骨细胞）、IL-1β组（用含10 ng∕mL的IL-1β的细胞培养液处理，构建软骨细胞损伤模型）、IL-1β+ALA-L组（用含10 ng∕mL 的IL-1β 和0.1 μmol∕L 的α-硫辛酸的细胞培养液处理）、IL-1β+ALA-M组（用含10 ng∕mL的IL-1β和1 μmol∕L的α-硫辛酸的细胞培养液处理）、IL-1β+ALA-H组（用含10 ng∕mL的IL-1β和10 μmol∕L的α-硫辛酸的细胞培养液处理）、IL-1β+anti-miRNC 组（转染anti-miR-NC 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β细胞培养液处理）、IL-1β+anti-miR-877组（转染antimiR-877 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 细胞培养液处理）、IL-1β+pcDNA 组（转染pcDNA 后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 细胞培养液处理）和IL-1β+pcDNANDRG2 组（转染pcDNA-NDRG2 后，用含10 ng∕mL的IL-1β细胞培养液处理）。干预处理时间为48 h。为进一步验证α-硫辛酸是通过调控miR-877 ∕NDRG2 通路进而影响IL-1β 诱导的软骨细胞损伤，把miR-NC和miR-877 mimics分别转染软骨细胞后，用含10 ng∕mL 的IL-1β 和10 μmol∕L 的α-硫辛酸的细胞培养液干预处理，标记为IL-1β+ALA+miR-NC组和IL-1β+ALA+miR-877组，并进行后续分析。建模IL-1β浓度参考文献［9］，α-硫辛酸浓度梯度设定参考文献［10］。

1.4 qRT-PCR检测

收集按照“1.3”进行相应干预处理的各组软骨细胞，经PBS 液漂洗后，利用Trizol 试剂于冰上提取总RNA，逆转录为cDNA 后，以cDNA 为模板进行qPCR 扩增。分别以U6 和GAPDH 为内参基因，按照2法计算miR-877 和NDRG2 mRNA的相对表达量。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集按照“1.3”进行相应干预处理的各组细胞，用预冷的PBS 液洗涤细胞，离心弃去上清液，用1×Binding Buffer 重悬细胞，调整细胞密度为1×10个∕mL。取100 μL细胞悬液加入流式管内，再加入5 μL 的Annexin V-FITC，混匀后，室温避光孵育10 min，加入5 μL的PI染液，继续孵育5 min 后，补加PBS 至500 μL，轻轻混匀后，进行上机检测。

1.6 试剂盒检测IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量

收集1.3进行相应干预处理的细胞培养液，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤进行。

1.6.1 蛋白质印迹法检测蛋白表达情况 收集按照“1.3”进行相应干预处理的各组细胞，经PBS漂洗后，离心弃取上清液，用适量预冷的RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照1∶4比例加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后，煮沸3～5 min使细胞蛋白变性；取30 μg 蛋白样品上样进行SDSPAGE 凝胶电泳；电泳结束后，进行常规湿法转膜（PVDF）；转膜结束后，加入Western 封闭液室温条件封闭1 h；Western洗涤液漂洗10 min，漂洗3次，加入已稀释的NDRG2（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）以及GAPDH（1∶2 500）Ⅰ抗室温孵育2 h；Western 洗涤液漂洗10 min，漂洗3 次；加入Ⅱ抗室温孵育1 h；Western洗涤液再次洗膜后，进行ECL显影；Image J软件分析目的条带灰度值（以GAPDH为内参）。

1.6.2 双荧光素酶报告基因实验 利用生物信息软件对miR-877 的靶基因进行预测，发现miR-877与NDRG2 能够特异性结合，猜测NDRG2 是miR-877 的靶基因，并进行验证。构建野生型WTNDRG2和突变型MUT-NDRG2的NDRG2-3’UTR荧光素酶报告基因载体，利用Lipofectamine2000 将miR-877 mimics 和miR-NC 分 别 与WT-NDRG2 和MUT-NDRG21 共转染软骨细胞，培养48 h 后，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.7 统计学方法

利用SPSS 20.0学软件进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，之后组间两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响

与Con组比较，IL-1β组软骨细胞促炎因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低，促凋亡蛋白Bax 的表达升高，细胞凋亡率升高；与IL-1β组比较，IL-1β+ALA-L组、IL-1β+ALA-M组和IL-1β+ALA-H 组软骨细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表达升高，Bax蛋白的表达降低，细胞凋亡率降低，且随着α-硫辛酸浓度的增加，细胞凋亡率逐步降低（P＜0.05）。见表1。以上结果表明，IL-1β可诱导软骨细胞损伤，α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤具有保护作用。

表1 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响∕

2.2 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞中miR-877和NDRG2表达的影响

图1 和表2 显示，与Con 组比较，IL-1β 组软骨细胞miR-877 的表达水平升高，NDRG2 mRNA 和NDRG2 蛋白的表达水平降低；与IL-1β 组比较，IL-1β+ALA-L 组、IL-1β+ALA-M 组和IL-1β+ALA-H 组软骨细胞miR-877 的表达水平降低，NDRG2 mRNA和NDRG2蛋白的表达水平升高，且随着α-硫辛酸浓度的增加，miR-877 的表达水平逐渐降低，NDRG2的表达水平逐渐升高（P＜0.05）。以上结果表明，α-硫辛酸可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞中miR-877的表达，促进NDRG2表达。

图1 NDRG2蛋白免疫印迹图

表2 α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞中miR-877和NDRG2表达的影响∕

2.3 miR-877靶向调控NDRG2的表达

利用生物信息学软件预测miR-877 靶基因显示，miR-877 和NDRG2存在部分连续的结合位点，见图2A。表3显示，与miR-NC和WT-NDRG2共转染组相比，miR-877和WT-NDRG2共转染组软骨细胞的荧光素酶活性降低（P＜0.05）；与miR-NC和MUT-NDRG2共转染组相比，miR-877和MUT-NDRG2共转染组软骨细胞的荧光素酶活性变化无统计学意义。图2B显示，与miRNC组比较，miR-877组软骨细胞中NDRG2蛋白表达量显著降低［（0.23±0.03）比（0.65±0.06），P＜0.05］；与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-877组软骨细胞中NDRG2蛋白表达量显著升高［（0.98±0.08）比（0.63±0.05），P＜0.05］。以上结果表明，NDRG2是miR-877的靶基因，miR-877可负性调控NDRG2的表达。

图2 miR-877靶向调控NDRG2的表达：A为NDRG2的3’UTR序列中含有与miR-877互补的核苷酸序列；B为NDRG2蛋白免疫印迹（WT-NDRG2为野生型NDRG2荧光素酶报告载体，MUT-NDRG2为NDRG2为突变型NDRG2荧光素酶报告载体）

2.4 抑制miR-877 表达对IL-1β 诱导的软骨细胞损伤的影响

表4和图3显示，与Con组比较，IL-1β组软骨细胞miR-877的表达水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表达水平降低，Bax蛋白的表达水平升高，细胞凋亡率增加；与IL-1β+anti-miR-NC 组相比，IL-1β+anti-miR-877 组软骨细胞miR-877 的表达水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌减少，Bcl-2 蛋白的表达水平升高，Bax 蛋白的表达水平降低，细胞凋亡率降低（P＜0.05）。表明，抑制miR-877 表达可减轻IL-1β 诱导的软骨细胞损伤。

表3 双荧光素酶报告实验∕

图3 凋亡相关蛋白表达

2.5 NDRG2过表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响

表5和图4显示，与Con组比较，IL-1β组软骨细胞NDRG2 蛋白的表达水平降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌增加，Bcl-2 蛋白的表达水平降低，Bax蛋白的表达水平升高，细胞凋亡率增加；与IL-1β+pcDNA 组比较，IL-1β+pcDNA-NDRG2 组软骨细胞NDRG2蛋白的表达水平升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌减少，Bcl-2蛋白的表达水平升高，Bax蛋白的表达水平降低，细胞凋亡率减少（P＜0.05）。这表明，过表达NDRG2 可减轻IL-1β 诱导的软骨细胞损伤。

2.6 过表达miR-877 逆转了α-硫辛酸对IL-1β 诱导的软骨细胞损伤的作用

表6 和图5 显示，与IL-1β 组比较，IL-1β+ALA 组软骨细胞miR-877 的表达降低，NDRG2 蛋白的表达升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌降低，Bcl-2蛋白的表达升高，Bax蛋白的表达降低，细胞凋亡率降低；与IL-1β+ALA+miR-NC组比较，L-1β+ALA+miR-877组软骨细胞miR-877的表达升高，NDRG2蛋白的表达降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌升高，Bcl-2蛋白的表达降低，Bax蛋白的表达升高，细胞凋亡率增加。表明，过表达miR-877能够逆转α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用。

表4 抑制miR-877表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响∕

表5 NDRG2过表达对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响∕

表6 miR-877过表达逆转了α-硫辛酸（10 μmol∕L）对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用∕

图4 NDRG2和凋亡相关蛋白免疫印迹图

图5 NDRG2和凋亡相关蛋白免疫印迹图

3 讨论

α-硫辛酸是一种天然存在的硫醇抗氧化剂，它不仅在糖尿病方面有广泛的临床应用，而且在心血管疾病和肝肾疾病中也有广泛的应用。最近的研究表明，α-硫辛酸通过抑制IRF-1 的转录活性发挥抗炎作用，从而对IL-1β 诱导的软骨细胞具有保护作用；α-硫辛酸还可增加牛油果和大豆非皂化物对体外培养的软骨细胞的抗炎活性。此外，α-硫辛酸还可抑制NF-κB通路活化，抑制TNF-α分泌，对碘乙酸钠诱导的骨关节炎大鼠软骨细胞具有保护作用。本研究发现，α-硫辛酸呈浓度依赖性地抑制IL-1β诱导的软骨细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，抑制Bax 的表达，促进Bcl-2 的表达，抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，发挥保护作用，这与Sun等的研究结论相一致。同时，本研究发现α-硫辛酸呈浓度依赖性地抑制IL-1β 诱导的软骨细胞miR-877的表达，促进NDRG2 表达。此外，双荧光素酶报告基因实验和western blot 检测显示，miR-877 可负性调控NDRG2 的表达。因此，推测α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞的保护作用可能与miR-877 ∕NDRG2分子轴的异常表达有关。

近年来，随着对miRNA 研究的不断深入，miRNA 与细胞凋亡、损伤的联系越来越清晰。前人研究发现，miR-877参与多种细胞的凋亡过程，在X射线引起的视网膜神经节细胞损伤中，miR-877 表达上调，miR-877 通过调控其靶基因参与视网膜神经节细胞的放射损伤过程；同时，miR-877表达上调还参与曲伐沙星等多种药物诱导的肝损伤过程；此外，下调miR-877表达对阿司匹林所诱导的胃黏膜细胞损伤具有保护作用。本研究发现，抑制miR-877 表达可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ 的分泌，降低Bax 的表达，增加Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。提示抑制miR-877表达与α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用一致。

NDRG 基因家族包括NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4四个家族成员，是近年发现的一类细胞内信号分子。NDRG2 基因定位于染色体14q11.2 位点，作为一种抑癌基因，NDRG2 基因的表达缺失与结肠癌、胃癌等恶性肿瘤的发生密切相关。同时，NDRG2 还可在应激条件下发生改变，影响细胞的生理和病理过程。在大鼠心肌缺血再灌注损伤中NDRG2 表达下调；在肺缺血再灌注损伤中，过表达NDRG2 可抑制炎性因子TNF-α、IL-6 表达，抑制病理组织的炎性改变。本研究发现，过表达NDRG2 可抑制IL-1β 诱导的软骨细胞炎性因子IL-6、TNF-α、IFN-γ的分泌，降低Bax的表达，增加Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡。提示miR-877∕NDRG2分子轴参与对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的调控。为进一步验证α-硫辛酸对调控miR-877∕NDRG2 分子轴对IL-1β诱导的软骨细胞发挥保护作用，将miR-877转染软骨细胞，经IL-1β 诱导和α-硫辛酸干预处理后，发现miR-877过表达可逆转α-硫辛酸对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的影响。提示，α-硫辛酸通过调控miR-877∕NDRG2通路对IL-1β诱导的软骨细胞损伤具有保护作用，在RA 等炎症相关关节疾病的预防和治疗中具有科研前景。

综上所述，α-硫辛酸通过减弱炎症反应，抑制细胞凋亡，对IL-1β 诱导的软骨细胞损伤具有保护作用，其机制与调控miR-877∕NDRG2通路有关。本研究的发现为α-硫辛酸在RA的临床应用奠定了理论基础。