基于PCR的稀有突变检测方法

张绚，张宏刚

（1.国家知识产权局专利局专利审查协作广东中心，广东广州 510500；2.广州格拉姆生物科技有限公司，广东广州 510530）

基因突变是指由于DNA分子中碱基对的增添、缺失或改变而引起的基因结构的改变。稀有突变则指存在大量的野生型背景的突变模板，即样品基因组的突变比例非常低[1]。目前，应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构和表达水平的变化的分子诊断技术在疾病的诊断和治疗中占据举足轻重的地位，而稀有突变的分子诊断作为基因突变检测的一个重要组成部分，在技术的建立到临床的应用过程中都面临着巨大的挑战[2]。

分子诊断中的很多领域都涉及了稀有突变的检测，主要包括以下3个方面。（1）一些稀有突变可作为癌症的早期诊断和预后标记物，这种检测常以组织切片、体液（如血浆或血清）、尿液或粪便为模板（基因组DNA或RNA）来源的进行突变检测。（2）病人的微小残留病的检测，微小残留病指癌症患者经过治疗并达到缓解后残留的肿瘤细胞，可用来监控病人的病情，预测病人的复发风险。（3）稀有突变的检测在疾病的分级应用中也占有一席之地。

稀有突变检测技术面临的一个最大的难题是在野生型模板量大大超出了要检出的突变模板量的情况下，如何能够尽量减小野生型模板的影响，从而高灵敏度地将突变模板筛查出来。目前的PCR检测技术为了解决这个难题，往往采用各种手段压制野生型模板的扩增，同时富集突变模板，使突变模板的浓度比例增高而易于检测。而在检测方法的选择上，需要根据实际情况，在灵敏度（即能检测到的最低突变比例）和准确性间找到平衡点，此外，还要考虑所选方法的简便性和成本。

基于PCR的稀有突变富集检测方法主要有两类，一类只能对已知突变进行富集检测，另一类则还能对未知突变进行富集检测。表1依据灵敏度的高低和富集对象的类型列出了较常见的一些基于PCR的检测方法。接下来将针对其中比较常用的方法进行介绍。

1 针对已知突变的中等灵敏度检测方法

目前，最常用的是ARMS和PNA或LNA介导的PCR。

1.1 ARMS

扩增阻碍突变系统技术[1-2]又称等位基因特异性PCR，在突变检测中应用很广泛。该检测方法基于TaqDNA聚合酶缺乏3'到5'外切校正活性，从而在ARMS引物的3'端设计等位基因特异性的碱基，有时为了提高特异性，还在引物的3'末端根据需要引入第二、第三个错配碱基。当引物结合于模板时，由于该ARMS引物与野生型模板和突变型模板的错配程度不同，而导致不匹配的模板的PCR延伸受阻，特异性地扩增匹配型模板。此技术与实时荧光PCR技术相结合，可以实现DNA突变的快速、准确、高通量检测。

用ARMS引物检测基因突变，建立体系时需全盘考虑，仔细优化多个反应条件，但最核心的部分是ARMS引物的设计与筛选。ARMS引物设计时需融入多种考虑因素，引物设计软件选择出的引物和分值往往和实际情况有偏差，也不能估算不完全匹配引物对模板的扩增能力，所以对于突变点需进行较多的引物筛选。在ARMS引物3'端引入错配时，考虑到不同突变类型序列不同，根据各个突变的序列特点，在3'端1、2、3位引入1～3个错配碱基，使所设计引物3'端与野生型匹配度最差，与待检测突变类型匹配度较高，然后在实验过程中需不断根据实验结果分析选择和调整引物。

表1 稀有突变检测方法

1.2 PNA或LNA介导的PCR

肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一种经过修饰的RNA，β-D-呋喃核糖的2’-O、4'-C位通过缩水作用形成刚性结构。PNA和LNA都具有如下特点：（1）可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成比ssDNA或ssRNA更稳定的复合体；（2）DNA聚合酶对其没有延伸活性；（3）在PCR反应过程中不会被DNA聚合酶酶切。正是基于这些特点，PNA[12-14]和LNA[15-16]常用于PCR反应中锁住野生型模板的“夹子”，以避免野生型模板的扩增，从而使突变模板浓度升高而易于检测。

2 针对已知突变的高灵敏度检测方法

2.1 数字PCR（Digital PCR）和PAP-ASA

数字PCR[19-21]利用核酸样品做模板，混合成完整的PCR体系后，将数微升的PCR反应体系随机分布到将近1 000个纳米级的反应仓（Reaction Chamber）中去。当起始的核酸模板浓度足够低时，单分子核酸就会出现在反应仓格子中，对PCR产生荧光信号的格子进行计数，从而达到对所研究的基因进行检测或定量。该技术在基因突变检测、拷贝数变化检测及基因分型中应用较为广泛。

PAP-ASA技术是近几年发展起来的一种稀有突变检测技术，该技术利用了Taq聚合酶的焦磷酸水解活性和聚合活性。与普通引物不同的是，PAP引物的3'末端采用了ddNTP修饰，当该ddNTP与模板匹配时，Taq聚合酶的焦磷酸水解活性将其水解去除，从而恢复PAP引物的延伸能力；当该ddNTP与模板不匹配时，焦磷酸不被水解，从而无法延伸。焦磷酸水解活性的特异性和聚合酶活性本身的特异性相互叠加形成了PAP反应无可比拟的高特异性，灵敏度理论上可达10-9。目前，PAP的定性检测通常采用先扩增后电泳分析结果的方法，不仅需要较长的时间和较大的劳动强度，而且PCR产物的后处理很容易导致样品间的交叉污染，这对于稀有突变检测来说是致命的。Song等人[23]将PAP技术整合到实时PCR检测平台，将扩增和检测合二为一，不需要任何后操作，有效杜绝了产物污染，还具有卓越的定量能力。

然而，由于PAP反应涉及酶的两次反应，所以需要较长的反应时间和较缓慢的升温，运行这类程序对实时PCR仪有一定的损耗。

2.2 Snapback Primers and Rapid-Cycle PCR

Snapback引物联合快速PCR[24-26]方法设计了一种Snapback引物，该引物包括两部分，延伸部分（3′端）和尾巴部分（5'端）。延伸部分（3'端）为普通PCR引物；尾巴部分（5'端）与目的基因发生突变的区域互补，突变碱基所在位置位于此尾巴的中间。这样做的目的是，当该引物以野生型序列为模板，扩增出野生单链时，该单链5'端由于互补序列的存在，将会形成一个稳定的手柄结构，从而阻抑聚合酶的进一步扩增。当该引物以突变序列为模板进行扩增时，扩增出的产物DNA虽也可形成手柄结构，但由于突变的存在，该手柄结构极不稳定，易打开而发生聚合，由此便对突变模板进行富集。另外，Snapback引物的5′端还需引入两个无关碱基来阻止形成手柄结构后的自引物延伸作用。这种方法需要联合快速循环PCR，需要变温速率较高的PCR仪。

3 针对未知突变的富集检测方法

针对未知突变的检测方法往往涉及很多种酶的使用，增加了检测方法的复杂性和操作时间。但是COLD-PCR[38-43]只通过改变扩增的程序即可达到对突变模板的富集。

COLD-PCR的基本原理是：当模板DNA中有突变存在时，扩增产物会形成两类DNA双链：同源二聚体双链和异源二聚体双链。这时，可通过降低退火温度（Tc），选择性地将含有突变的异源二聚体双链打开，进一步进行扩增延伸，从而达到突变富集的作用。这里的退火温度是COLD-PCR中最关键的因素，关系到整个COLD-PCR的成功与否，需要对其进行非常细致的优化。此外，为了增大同源二聚体双链和异源二聚体双链之间稳定性的差异，PCR产物不宜太长，一般200 bp以内为佳。

COLD-PCR有两类，一种是完全COLD-PCR（Full COLD-PCR），另一种是快速COLD-PCR（Fast COLD-PCR）。前者可对所有的突变类型进行富集，后者则只对发生突变后稳定性下降，DNA解链温度（Tm）下降的DNA链进行富集。因不同的需要可选用不同的类型。在都适用的情况下，后者的富集效果往往好于前者。

此外，发明COLD-PCR的作者还分析了两类COLD-PCR对不同突变类型的富集程度。如C-G到T-A或A-T突变，完全COLD-PCR可富集5～12倍，快速COLD-PCR可富集10～100倍；T-A到A-T或C-G到G-C的突变，完全COLD-PCR可分别富集5～8倍和3～5倍；对于插入和缺失突变，完全COLD-PCR可富集50倍以上，快速COLD-PCR可富集100倍以上。

4 结语

稀有突变是突变检测的一个重要组成部分，也是目前临床应用上面临的一个巨大挑战。目前，稀有突变的检测方法很多，但方法的高灵敏度往往意味着其复杂性。而且，有些方法也具有需昂贵仪器、费时或检测成本高等缺点。此外，随着人们对稀有突变的生物和临床特性研究的深入，针对稀有突变的检测技术也必会随之不断发展。