前前脑-丘脑环路在全脑缺血期间低温诱导的脑保护中的作用

王小华，聂彬彬，李燕虹，赵 菁，张 婷，王天龙，姜 伟

心脏骤停(CA)具有极高的死亡率及严重脑功能障碍后遗症，并给公众健康带来了巨大的负担。在1985年-2018年期间，院内心脏骤停(IHCA)后的1 y生存率较差，为13.4%。院外心脏骤停是世界范围内死亡的主要原因，生存率为13%，并且大多数幸存者患有永久性缺氧性脑损伤[1～3]。

近年来的研究证明，对CA后的造成的全脑缺血(GI)，低温具有脑保护作用[4,5]，92%的患者在接受低温治疗后恢复到正常或接近正常的神经功能水平[6]。临床结果提供了强有力的证据，1例大型随机对照试验得出结论，心肺复苏后，32 ℃～34 ℃低温减少恢复期脑功能障碍[7]。鉴于低温在GI中的重要性，以往的研究已经在相关的RNA、蛋白质和细胞因子水平研究了其潜在的脑保护机制[8]。在GI条件下,低温也保护神经元线粒体和神经血管单位[19]。3项利用核磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)大型试验表明，低温降低了脑损伤的频率和严重程度[10～12]。然而，到目前为止，低温在脑网络的功能和代谢活动中的保护机制尚不清楚。

在本研究中，我们使用18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(18F-FDG-PET)定量测定低温及常温全脑缺血后，低温对不同脑区和节点的葡萄糖代谢的保护作用。此外，我们还利用扩散张量成像(diffusion tense image,DTI)造影重建受低温保护的脑白质连接网络。

1 材料和方法

1.1 动物模型 研究方案得到首都医科大学动物伦理委员会的批准，按照法律和道德的动物护理国际准则，18只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(北京维塔尔河实验动物技术有限公司，许可证编号:SCXS2001-0017)，9～11 w龄，体重320～350 g，随机分为3组。低温GI组：(6只大鼠)建立GI模型的同时体温维持在31 ℃～33 ℃。具体：将温度探头插入直肠，将大鼠放置在冷却/温热毯上，将其连接到恒温控制系统，通过反馈调节来保持温度，在25 min的降温期间，用酒精喷洒在大鼠的皮毛上，以降低体温，低温期维持期150 min，后大鼠复温30 min，再保持正常温度直至扫描。常温GI组：(6只大鼠)采用相同系统的冷却/温毯建立GI模型，体温始终维持在37 ℃～37.5 ℃，持续时间约为150 min。假手术组：(6只大鼠)维持在37 ℃～37.5 ℃，颈部正中切口，但不诱导GI模型(见图1)。

图1 记录低温全脑缺血(GI)组和常温全脑缺血GI组的直肠温度，反映全脑缺血模型过程中的体温稳定性

通过Longa技术行双血管闭塞(2VO)构建GI模型[13～15]。颈外静脉插入导管抽血，左股动脉进行血压监测，右股动脉进行药物输注。颈部正中切口，双侧颈总动脉(CCA)被分离并与下方放置结扎线。肝素(150 IU/kg)静脉注射，通过颈静脉导管抽血，维持40～50 mmHg的平均动脉压(mean blood pressure)MBP。在手术过程中，注意保留迷走神经，测量血气，调整插管期间呼吸器的潮气量，以达到动脉血氧分压(PaO2)>90 mmHg，动脉二氧化碳分压(PaCO2)为35～45 mmHg，pH为7.35～7.45。结扎左侧CCA 10 min后，结扎右侧CCA，最终阻断脑血流。共15 min后，缓慢通过颈静脉导管回灌血液，注入0.5 ml碳酸氢钠(0.6 M)。在135 min的恢复期后，伤口被缝合，大鼠被送回笼子。

1.218F-FDG-PET和DTIMRI数据采集 建立GI模型后24 h对大鼠进行扫描。在18F-FDG注射前，所有大鼠都禁食12 h～15 h，但在任何时候都可以获得饮用水。18F-FDG是从atom-hitech(HTA)技术有限公司(中国北京)(www.atom-hitech.com)获得的。每只大鼠18F-FDG(体重18.5 MBq/100 g)经尾静脉注射，后大鼠被关在笼子里，并被放置在一个环境噪声最小的房间中40 min，以摄取18F-FDG。脑内18F-FDG摄取最大化的摄取周期为40 min。随后，大鼠在扫描过程中使用鼻吸入异氟醚麻醉(100%氧气中2% IsoFlo)(河北久木制药有限公司，中国)，并将塑料立体定向头架放置在扫描仪床上的俯卧位置上。在动物PET系统(中国科学院高能物理研究所，E-plus260)上获得18F-FDG-PET图像，其径向空间分辨率为1.55 mm全宽半最大值(FWHM)，位于视野中心(FOV)。在FDG-PET扫描过程中，大鼠大脑以FOV为中心进行静态采集10 min。然后利用有序子集期望最大化(4次迭代，12次子集)算法对图像进行重构。在90×97×200矩阵上重建它们，体素大小为0.5×0.5和1 mm3。最后，所有扫描都以分析格式保存。使用7.0T动物MRI扫描仪(70/16扫描，BrukerBiospinGmbH，德国)获得DTI数据，使用38毫米大鼠脑正交谐振器进行射频传输和接收。用回波平面成像序列[重复时间(TR)=12000 ms、回波时间(TE)=32.248 ms、矩阵大小163获得DTI图像=128×128×48，体素大小=0.35×0.35，0.56 mm，无片间隙]。沿30个独立轴施加扩散加权，b值为1000 s/mm2。获得了5幅b值为0 s/mm2的参考图像。最后，所有原始的Bruker图像都被转换为DICOM格式，软件程序(Paravision 5.0)内置在扫描仪。

1.318F-FDG-PET图像分析 所有18F-FDG-PET图像的数据分析在SPM8(Wellcome，认知神经学系，伦敦，英国)的SpmratIHEP工具箱中进行。首先，使用MRIcro手动移除所有图像的身体组织和背景，并在D3V重新定位图像的来源，这与Paxinos & Watson空间中的标准18F-FDG-PET模板相对应。然后，将单个大鼠脑图像空间归一化为Paxinos和Watson空间，将分析头中的体素大小放大4倍，注册到18F-FDG-PET模板，通过颅内图像去除颅外组织，剪切矩阵以切去背景。最后，将所有归一化的18F-FDG-PET图像用高斯核2×2×4 mm3FWHM平滑。进一步体素统计分析，所有平滑的数据都是基于一般线性模型(GLM)框架的体素分析。为了确定18F-FDG信号的显着性差异，使用SPM8进行了检测。采用基于无偏尺度因子的比例缩放和强度归一化来解释混杂因素。最后，根据体素水平的高度阈值P值<0.005，得到了具有显著18F-FDG变化的脑区。错误发现率(FDR)校正在多个比较在集群级别进行。通过基于体素的分析对数据进行分析,每个束的内部轮廓的调整也根据矢状面和横截面进行解释(大鼠大脑图谱的立体定向坐标，x轴对中线左侧为负，对右侧为正;y轴对腹方向相对于背侧方向为正;z轴对嗅球相对前囟为正，对小脑方向为负)。当低温GI组或常温GI组与假手术组比较时，如果18F-FDG摄取低于假手术组，并提示低代谢区(则显示冷色蓝色);如果18F-FDG摄取高于或等于假手术组，则提示高代谢区(显示为暖色，橘红及红色);如果18F-FDG摄取等于假手术组，则提示等代谢区(显示为灰色)。KE值表示集群的大小，即表示低体积区的体积。

1.4 MRIDTI图像分析 所有DTI图像在FSL(FMRIB软件库)(http://fmrib.ox.ac.uk/fsl)中进行预处理。简单地说，使用FMRIB的扩散工具箱在FSL中去除头动和涡流。然后计算每个单束的分数各向异性(Flip angle)(FA)和平均扩散率(Mean diffusion)(MD)。随后，在SpmratI HEP工具箱(SPM8)中对FA和MD图像进行体素分析。简单地说，通过颅骨剥离和重新定位原点，对FA和MD数据集进行了预处理。然后，将FA图像空间归一化为Paxinos & Watson空间中的FA模板图像，并与MD图像一起归一化并进行平滑。最后，基于GLM框架对所有平滑数据进行体素分析，基于体素水平的高度阈值(P<0.005)对脑区进行显著FDG变化比较，并通过多重比较进行FDR校正。

1.5 统计学分析 在SmraIHEP中进行统计分析如下：平均低温GI组和常温GI组的值，与假手术组进行比较。显著性水平定期设定为P<0.05。基于广义线性模型。建立平滑平均归一化摄取值18F-FDG-PET数据的统计分析模型，通过低温GI组和常温组建立两个样本t检验分析。在KE中计算(Mn-UV)，对于聚类中的体素数，它直接反映了区域的体积。Tmax值是每个集群中的最大t值，Tmax值>1表示差异显著。峰值坐标(mm)是Paxinos & Watson空间中最大点的坐标。

2 结 果

2.1 PET扫描分析结果显示，低温全脑缺血组和常温全脑缺血组，脑中低代谢区域的差异 在PET扫描中的伪彩色方格显示了低温/常温GI组与假手术组相比，在显著不同的区域的FDG摄取变化显示(见图2A、B)中。低代谢区域(蓝色区域)反应受损伤区域，与低温GI组相比，常温GI组的大鼠脑中低代谢区域明显范围更大(见图2A、B)。

图2 与低温全脑缺血组相比，常温全脑缺血组的低代谢区明显增大。冷伪色(蓝色)表示相对于假手术组的低代谢区域，而暖伪色(橘色)则表示相对于假手术组的高代谢区域。(A)常温全脑缺血组冠状切面；(B)低温全脑缺血组的冠状切面

我们进一步分析了低温保护区域的分布情况，我们发现低温全脑缺血组，前脑和丘脑的相对保存完好。此外，低温全脑缺血组GI组丘脑区低代谢区较常温全脑缺血组GI组明显缩小(见图3A、B)。与常温GI组相比，低温GI组在前前脑皮质(PFC)和丘脑(Ts)也有的低代谢区明显较小(见图3A、B)。这些结果提示，全脑缺血条件下低温有选择性的保护前前脑(皮质)和丘脑(皮质下部分)。

图3 低温GI组丘脑(Ts)区低代谢区(蓝色区域)较常温GI组明显消失。前前脑皮质(PFC)和感觉皮质(SC)的低代谢区(蓝色区域)在低温GI组也明显较小。冷伪色(蓝色区域)表示相对于假手术组同脑区的低代谢区域，而暖伪色(红色区域)则表示相对于假手术组高代谢区域。(A)常温GI组的冠状切面;(B)低温GI组的冠状切面;(C)常温GI组的矢状面;(D)低温GI组的矢状面。前前脑皮质：PFC；Ts丘脑；SC感觉皮质

同时，体素分析的精确数据结果显示(见表1)，统计结果的定量信息列于表1，其中“KE”表示每个簇中的体素数，即KE数代表具有显著低代谢的特定区域的体积。Tmax表示每个集群中的最大t值。Ts丘脑区是前前脑丘脑中间环路的中心，在低温GI组与常温GI组相比明显缩小。常温GI组丘脑区(Ts区)KE=2391(Tmax=6.1129)，低温GI组KE=342(Tmax=5.8853)(见表1)。PFC是前前脑-丘脑环路中一个非常重要的区域，低温GI组与常温GI组相比，PFC区的低代谢区域(蓝色区域)也明显缩小。常温GI组PFC区KE值=553(Tmax=4.2414)。在低温GI组中，KE值=71(Tmax=6.8144)(见表1)。在低温GI组中，前前脑环路关键性节点结构的保存，这表明与低温参与此区域的细胞的保护。

表1 在低温全球缺血组和常温全球缺血组中，簇大小代表簇内体素数的KE值。两组之间的两个样本t检验的统计结果

2.2 MRI T2结果分析显示与低温全脑缺血组相比，常温全脑缺血损伤丘脑区损伤明显 从MRI T2可以看出，在低温全脑缺血组中几乎观察不到直接的脑损伤表现，而常温全脑缺血组损伤明显。而损伤区域的差异，集中在丘脑区域。

2.3 DTI结果分析显示，低温全脑缺血与常温全脑缺血白质纤维结连上的差异 从DTI结果来看，所有白质纤维都在皮质下和皮质结构之间进行了跟踪(见表2)。白质纤维中的各向异性(FA)值高提示白质纤维的保存完好。前前脑-丘脑环路的主要连接白色纤维是内囊(IC)和胼胝体(CC)，它们FA在低温GI组较高，与常温GI组比较，FA-IC(分别为0.458±0.058和0.710±0.159)；FA-CC(分别为0.384、0.01和0.408±0.051；P<0.01和P<0.05)。FMI、MLF和SM也是前脑丘脑中间回路的结缔组织纤维。胼胝体(FMI)[(0.928±0.071)vs(0.696±0.121)；P<0.05]、内侧纵束(MLF)[(0.894±0.050)vs 2560.661，0.131；P<0.05]和丘脑中纹(SM)[0.405，0.209，(0.225±0.064)；P<0.05]。在低温的保护下，前前脑-丘脑环路白质纤维的功能/结构损伤明显降低(见表2)。

表2 基于FA值的中间电路中白质束的详细信息

图4 常温全脑缺血组与低温全脑缺血组，在MRI T2图像上的脑损伤差异。常温全脑缺血组丘脑区有明显的损伤。(A)常温全脑缺血组;(B)低温全脑缺血组

3 讨 论

我们的研究发现低温GI组与常温GI组相比，前前脑-丘脑环路神经元代谢活性和连接组织纤维明显保留。理论上，全脑缺血应当在所有脑区产生相对均匀的细胞损伤，然而，我们发现低温在特殊的神经元群体和不同的脑区对缺血产生分级和差异性保护。本研究发现低温GI组低代谢区相对较低。在低温GI组中，前前脑神经元代谢活性得到了显著的保留，如18F-FDG-PET发现所示。低温可选择性地保留丘脑和PFC的代谢激活。此外，MRI结果也支持了这一观察，在DTI中，FA还显示了CC和IC的保存，这是前前脑-丘脑环路纤维连接。在我们的研究中，PFC、丘脑和相关连接被低温显著保存，被确定为前脑丘脑中间回路的关键成分[16]。前前脑-丘脑环路被选择性地保留，表明该环路在低温保护中起着关键作用。前前脑-丘脑环路是维持正常意识、唤醒和睡眠觉醒的核心环路[17]。此环路在从具有潜在保留意识的昏迷中恢复中起着关键作用，也为中枢丘脑作为唤醒神经调节的特殊节点提供了概念基础[18]。

总之，低温选择性地保护了整个大脑中的特殊连接节点和功能和代谢大脑活动中的相关网络。在GI期间，整个大脑的血液供应明显减少，然而，在低温治疗后，前前脑-丘脑环路的关键部位被保留下来。基于18F-FDG-PET和DTI-MRI的发现，我们证明了在GI过程中低温保存前前脑-丘脑环路。前前脑-丘脑环路可能发展成为全脑缺血患者治疗的有力和潜在靶点，为严重瘫痪患者提供福音和希望。

4 致 谢

PET在中国科学院高能物理研究所北京放射技术与设备工程研究中心进行。作者感谢彭程对PET分析的帮助。作者还感谢薛景泉和杨文江进行PET扫描。