警报素S100A8/A9对骨关节炎相关细胞影响的研究进展

周松，蔡敏，李兴艳，黄克，项征，詹和龙，焦品一

(1.广西医科大学第三附属医院骨科，广西 南宁 530031；2.安徽省滁州市安徽涵博健康集团医院，安徽 滁州 239000)

随着老龄化人口的增加，骨关节炎(osteoarthritis，OA)现已成为是全世界最常见的慢性炎症性关节疾病，其影响不仅局限于某个地区，而是对全球的成年人都有着深远影响。进入21世纪以后，OA的发病人数更是逐年上涨。它是发达国家十大致残性疾病之一，对社会产生很大的经济负担。OA是一种高度异质性的疾病，影响所有滑膜关节，主要特征是关节软骨的进行性降解以及继发性滑膜炎和骨重塑，使患者出现关节疼痛、僵硬、行动能力降低、畸形等诸多临床问题。发展成OA的最主要危险因素就是年龄。近年来，国外学者发现警报素S100A8/A9在骨关节炎的发病过程中扮演者重要的角色，且S100A8/A9随着年龄的增长而分泌增多，但国内却缺少关于S100A8/A9与OA之间的相关研究。本文主要总结了近年来国外学者研究发现的S100A8/A9与参与骨关节炎发生、发展进程中相关细胞之间的相互关系。

1 OA的概述

OA是全世界最常见的慢性炎症性关节疾病，影响全球10%～15%的成年人，已成为一种快速发展的现代疾病[1]。在1990—2016年期间，观察到OA患病率由14.05‰增加到30.16‰，致残存活人数由和730万增加到1 630万[2]。它是发达国家十大致残性疾病之一，对社会产生很大的经济负担，估计社会成本在国内生产总值的1.0%～2.5%[3]。早在2008年，有症状的OA已成为美国医院治疗费用最高的疾病之一，通过关节置换术住院治疗的全国费用高达到约400亿美元[4]。

OA的主要特征是关节软骨的进行性降解以及继发性滑膜炎和骨重塑[5]。在OA的发展过程中，整个关节的代谢和结构逐渐改变，软骨受损、软骨下骨重塑和滑膜的慢性炎症[6-7]。发展成骨关节炎的主要危险因素是年龄、肥胖、代谢性疾病、性别、种族、营养、吸烟、骨密度、肌肉功能、关节创伤和不稳[8]。目前对于OA仍没有有效的治疗手段。根据OA的阶梯治疗原则[9]，首先建议超重和肥胖患者的减轻体重以降低症状性骨关节炎的风险。目前OA的药物治疗旨在减轻疼痛和缓解炎症，包括氨基葡萄糖和软骨素作为补充剂使用，阿司匹林和布洛芬被用于减轻炎症和疼痛，以及关节内注射局部给予皮质类固醇减少促炎介质的产生和单个核细胞的浸润[10]。OA的终末治疗仍然是关节置换手术。虽然OA可以通过关节置换得到有效的治疗，但也加重了患者的经济负担，并且患肢功能的改善和假体的寿命是有限的[11]。

在OA的进展过程中，软骨发生的病理改变包括氧化应激、炎症、细胞凋亡、基质丢失和自噬。在OA中，炎症细胞因子如白细胞介素(interleukin，IL)-1β通过刺激软骨细胞和滑膜细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)和一氧化氮(NO)的产生而增加氧化应激，导致软骨基质的合成和分解代谢失衡，导致软骨丢失[12]。小鼠模型的研究表明，生长因子，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β、wnt3a，以及信号分子，如β-catenin、Smad3和HIF-2α，参与OA的进展[7，13]。近年来，国外学者发现警报素S100A8/A9在骨关节炎的发病过程中扮演者重要的角色，但国内却缺少关于此方面的相关研究。

2 警报素S100A8/A9的概述

警报素S100A8/A9也称为钙保护素或MRP8/14，是一种小的钙结合蛋白。它们属于S100家族，于1965年首次作为神经蛋白从牛脑中提取出来。S100A8/A9主要由中性粒细胞和单核细胞释放，它们通常以异二聚体的形式存在[14]。S100A8/A9作为Ca2+感受器在中性粒细胞和单核细胞中组成性表达，参与细胞骨架重排和花生四烯酸代谢。存在于中性粒细胞、单核细胞、激活的巨噬细胞、角质形成细胞、上皮细胞以及破骨细胞的细胞质中。和所有的警报素一样，S100A8/A9 发挥着各种细胞内功能。在炎症和组织损伤过程中，S100A8/A9被释放到细胞外环境中，从而警报免疫系统。S100A8和S100A9都具有带电荷氨基酸残基的螺旋-环-螺旋序列，使得它们对Ca2+和Zn2+等二价离子具有高亲和力[14]。与二价离子结合改变了S100A8/A9的构象，从而发挥其相应的功能。人S100A8/A9形成异二聚体，甚至是更高的寡聚形式。最近报道了S100A8和S100A9的四聚体。四聚体的形成严格依赖于钙的存在，在没有钙的情况下，异源二聚体是人S100A8/A9的主要形式。近来发现S100A8/S100A9通过影响调节不同的细胞在OA中发挥作用，如：软骨细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和破骨细胞。下文将从这些细胞与S100A8/S100A9之间的关系分别阐述。

3 警报素S100A8/A9与参与骨关节炎病程的相关细胞

3.1 S100A8/A9与软骨细胞 在以往的研究中，用S100A8/A9刺激OA软骨细胞可以上调分解代谢标志物，如：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)(MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13)、白细胞介素(interleukin，IL)(IL-6、IL-8)和单核细胞趋化蛋白1，下调合成代谢标志物(聚集蛋白聚糖和II型胶原)，从而使软骨破坏[15]。例如，在最近对160例临床膝关节OA患者的研究中发现，IL-8不仅参与软骨细胞的破坏，还与膝关节症状、髌下脂肪垫信号强度改变以及骨和/或软骨生物标志物的血清水平呈正相关[16]。IL-8通过诱导一系列致病过程，如：(1)释放基质降解金属蛋白酶；(2)中性粒细胞聚集；(3)白细胞激活并归巢于滑膜；(4)诱导软骨细胞肥大和分化；(5)血管生成功能，在OA中持续发挥炎性作用[16]。S100A8/A9刺激软骨细胞产生基质金属蛋白酶，从而使周围的细胞外基质降解，并形成正反馈环驱动OA的发展[17]。软骨细胞通过增加包括MMPs(MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13)、具有凝血酶反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)-4和ADAMTS-5在内的基质降解酶的产生，以及软骨细胞表达的晚期糖基化终产物受体(receptors for advanced glycation end products，RAGE)和Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)-4通过非依赖性途径中的ADAMTS-4和ADAMTS-5，以适应细胞外S100A8/A9刺激[18]。在MMPs中，MMP-3直接参与破坏Ⅱ型和Ⅸ型胶原端肽的胶原交联，导致纤维结构和功能的破坏[19]。MMP-10具有与MMP-3相似的结构和底物特异性，可以激活与软骨老化相关的原胶原酶；而MMP-13是一种在关节软骨II型胶原降解中起重要作用的酶[15]。在OA中，S100A8/A9可以直接刺激软骨细胞产生MMP-3和MMP-13[18]，血清MMP-3、MMP-10和MMP-13也有正相关性[16]。所以S100A8/S100A9可能通过上调这些MMPs的表达在软骨损伤中发挥作用。

3.2 S100A8/A9与单核细胞 单核细胞是整个炎症性OA过程中滑膜内的主要炎症细胞[12]。小鼠中存在Ly6C高水平和Ly6C低水平两种类型的非经典巡逻单核细胞[20]。小鼠Ly6C高水平和Ly6C低水平与的人类经典CD14+CD16-和非经典CD14+CD16+相对应。Ly6C高水平单核细胞表达高水平的C-C趋化因子受体2(C-C chemokine receptor 2，CCR2)并在C-C趋化因子配体2(C-C chemokine ligand 2，CCL2)的引导下参与清除组织碎片，主要产生促炎细胞因子如IL-1β和S100A8/A9。相反，Ly6C低水平单核细胞表达高水平的CX3C趋化因子配体1(CX3C chemokine ligand 1，CX3CL1)并被CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1，CX3CR1)吸引，释放合成代谢因子如血管内皮生长因子和TGF-β，参与关节组织的修复[20]。滑膜内Ly6C高水平单核细胞和Ly6C低水平单核细胞之间的相对数量和相互作用决定了炎症的严重程度，并调节组织病理变化的进一步发展。Cremers等[17]利用野生型C57BL/6(WT)和S100A9基因缺陷小鼠诱导胶原酶诱导的OA(collagenase-induced OA，CIOA)后，向关节内注射S100A8，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和逆转录定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测滑膜中单核细胞标志物、促炎细胞因子和趋化因子的表达。研究发现在整个CIOA过程中，S100A8和S100A9的mRNA水平明显增强；免疫定位显示S100A8/A9蛋白由炎症滑膜衬里内的单核细胞强烈表达[17]。相比之下，IL-1β、IL-1α和IL-6仅在早期升高[21]，研究表明CIOA中的滑膜炎症是由S100A8/A9所主导。S100A8/A9形成的异源二聚体与TLR4结合刺激附近的滑膜细胞释放趋化因子，吸引单核细胞聚集[22]。骨髓中的髓系前体细胞在生长因子如PU.1和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)的驱动下分化为Ly6C高水平单核细胞。局部炎症促进Ly6C高水平单核细胞从骨髓释放到循环中，在循环中它们保持该状态或转化为Ly6C低水平单核细胞[23]。CCL2的高水平，吸引更多Ly6C高水平单核细胞在滑膜聚集。此外，S100A8/S100A9更有利于炎症滑膜中Ly6C高水平单核细胞的存在，不仅通过趋化吸引，并通过抑制其向Ly6C低水平细胞的分化，从而维持更多的单核细胞群体进入促炎症状态[17]。Ly6C高水平单核细胞是S100A8/A9的有效生产者，使单核细胞群体保持在促炎状态并形成正反馈回路。

3.3 S100A8/9与巨噬细胞 OA的进展实际上是由试图修复受损组织的慢性炎症所驱动。OA的主要标志是多种类型的巨噬细胞，虽然OA中滑膜巨噬细胞较少，但它们对促炎细胞因子的产生至关重要。近来Fahy等[24]通过研究证实，OA滑膜中同时存在M1样巨噬细胞和M2样巨噬细胞，即用经典激活的M1和交替激活的M2巨噬细胞[25]。炎症阶段，巨噬细胞的特征是由生成炎症介质如组织坏死因子-α、干扰素-γ或病原体相关分子模式介导激活经典激活M1巨噬细胞[26]，M1巨噬细胞一旦被激活，这些巨噬细胞本身就会释放促炎细胞因子[IL-1、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]和其他组织损伤信号[25-26]。M2巨噬细胞表型与清除完成后的修复有关[25]。被IL-4和IL-13激活的M2细胞(或替代激活途径)释放生长和血管生成因子，如转化生长因子-β、血管内皮生长因子和表皮生长因子，并调节T细胞功能，促进受损组织的重塑[26]。van den Bosch等[27]发现耗尽巨噬细胞的OA滑膜细胞培养物不再产生炎症因子，用S100A9刺激巨噬细胞可以增加各种促炎因子和分解代谢因子表达。这表明巨噬细胞是调节OA滑膜激活中促炎因子释放的主要细胞类型，而S100A9是巨噬细胞的有效激动剂。此外，粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)分化的巨噬细胞更是S100A8/A9优先由表达和产生者[27]。在OA中，由GM-CSF分化的巨噬细胞产生的S100A8/A9可以极大程度上刺激GM-CSF分化的巨噬细胞和较小程度的刺激M-CSF分化的巨噬细胞来诱导OA滑膜中的促炎环境，从而也形成一个正反馈环，这可能是OA过程中关节破坏的重要原因之一。但是当Manferdini等[28]用脂肪间充质基质细胞将M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转变后，打破此正反馈环，S100A8和S100A9表达均明显减少。这也逆向证明了S100A8/9与巨噬细胞存在明显相关性。

3.4 S100A8/9与中性粒细胞 中性粒细胞是最早被招募到炎症部位的细胞之一，通过部署复杂的抗菌策略，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生ROS，在脱颗粒过程中释放细胞毒性产物，以及形成中性粒细胞外陷阱，在炎症早期中起关键作用。中性粒细胞也能够分泌一系列令人印象深刻的自分泌和旁分泌介质，包括细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化因子可以招募其他免疫细胞并调节它们的功能。在抗原诱导形成的关节炎小鼠模型中，关节中性粒细胞的数量与骨侵蚀的量之间存在着强烈而显著的相关性[29]。中性粒细胞是alarmin S100A8/A9的强大生产者。S100A8和S100A9能强烈促进多种促炎细胞因子产生并参与到OA病程中来，如IL-6、IL-8、趋化因子单核细胞趋化蛋白1、MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13，其主要受体为TLR-4[30]。一旦在细胞外环境中释放，S100A8和S100A9通过激活中性粒细胞(自分泌作用模式)或其他炎症细胞类型(旁分泌作用模式)，通过多的功能促进炎症过程的放大。在中性粒细胞内，Ca2+依赖性S100A8/A9异四聚体的形成可能是其生物活性的前提条件，这似乎受到S100A9翻译后修饰的调节。事实上，S100A9可以在激活的中性粒细胞和单核细胞中被p38MAPK在Threonin 113处磷酸化，并且这种磷酸化有助于微管重组和吞噬细胞迁移，而且还调节中性粒细胞NADPH氧化酶[31]。然而，分泌的S100A9的磷酸化状态以及这种磷酸化对S100A8/A9胞外活性的影响尚未被研究。最近研究指出，S100A9是中性粒细胞以磷酸化形式分泌的[32]。S100A9的磷酸化是S100A8/A9微管网络的调节因子，随意磷酸化S100A9的可以调节有效地从中性粒细胞分泌S100A8/A9[31]。S100A8/A9触发中性粒细胞趋化因子以及TNF-α的释放，中性粒细胞通过放大衍生的细胞因子和趋化因子的产生而发挥强大的自分泌作用[31]。因此，细胞外S100A8/A9可能协调免疫细胞向炎症部位的募集，也有助于炎症反应的持续进行。

3.5 S100A8/9与破骨细胞 OA是一种以软骨破坏、软骨下骨改变、骨赘形成等病理状态为特征的关节疾病，其中以软骨破坏为中心[33]。破骨细胞有着独特的吸收骨组织的能力，与成骨细胞和骨细胞一起，是整个骨转换过程中的关键。在OA中破骨细胞是一种重要的骨、软骨破坏因子[34]。降解软骨下骨和软骨所需的破骨细胞激活的吸收过程在重构骨关节炎过程中起着及其重要的作用[35]。

在Grevers等[36]早期的研究分析了S100A9基因缺陷小鼠和野生型对照小鼠关节炎中膝关节的破骨细胞的表达和骨破坏情况。研究表明在破骨细胞形成过程中添加S100A8会刺激破骨细胞的形成[36]。对于破骨细胞而言，肌动蛋白环的形成与其骨吸收的能力有密切的相关性[37]，而S100A8可以促进肌动蛋白环的形成，即增加了破骨细胞骨吸收的能力。S100A8是TLR-4的内源性配体[30]，诱导髓样分化因子88的细胞内易位，并激活IL-1受体相关激酶和核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-KB)，对破骨细胞分化和功能至关重要[38]。但当阻断S100A8与TLR-4受体的结合，则可以完全抑制破骨细胞数量的增加和骨吸收的增强[36]。

虽然S100A8/A9先前已被认为与骨吸收增加以及成熟破骨细胞分化和活化激活有关，但在最近的体外细胞培养研究中，Di等[39]却首次发现将破骨细胞前体暴露于S100A9会抑制其破骨潜能。核因子受体激活剂-kB(receptor activator of nuclear factor-kappa B，RANK)配体信号通路通过与RANK受体结合而参与破骨细胞的生存、增殖、分化和激活[40]。缺乏编码RANK的TNFRSF11A基因的特征是破骨细胞分化受阻导致严重的骨化病，而阻断RANKL-RANK与抗体的相互作用则可以有效地减少破骨细胞介导的骨吸收[41]。S100A9通过直接降低了RANK编码基因TNFRSF11A的表达及其下游信号传导，阻碍单核破骨细胞前体分化为破骨细胞[39]。实际上在人体中，巨噬细胞在S100A9作用下会增加各种促炎症因子的表达，如IL-1b、IL-8和TNF-a，而这些促炎介质能刺激破骨细胞分化和活性，因此S100A9有着促进破骨的作用[27]。因此S100A8/A9的抑制作用被认为是对成熟破骨细胞的促炎和刺激作用的负反馈环，为防止在无菌炎症条件下发生不受控制的骨吸收现象[39]。

综上所述，OA目前是世界范围内面临的重要临床问题。OA高致残率使得整个社会的医疗负担明显加重。虽然关节置换是目前最有效的治疗方案，但却不能解决所有的问题。目前研究发现在OA的病程中警报素S100A8/A9扮演者重要的角色，并且与OA发病的相关细胞(软骨细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和破骨细胞)都有着明显的相关性。在国外，S100A8/A9现已成为OA病情监测和治疗的热点。而随着中国逐步迈入老年社会，OA的患者也会逐年上涨，这就需要我们更加深入的去研究OA发病与治疗，以寻求一个更好的治疗方案。