外泌体与喉癌干细胞的研究进展

王正，卫旭东

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 耳鼻咽喉-头颈外科，甘肃 兰州 730000)

0 引言

喉癌是头颈部肿瘤中常见的肿瘤之一，对喉癌的治疗有手术和放化疗、生物治疗等，但其较高的复发和转移仍然是一大难题。迫切需要寻找其他新型有效的治疗方法，近年来，肿瘤干细胞理论的提出及外泌体的发现给我们带来了新的启发,可提供新的思路开发新的喉癌治疗方法。

1 肿瘤干细胞

1.1 肿瘤干细胞概念、来源与生理

肿瘤干细胞是一种能够产生异质肿瘤细胞的自我更新细胞[1]。传统的观点上，肿瘤是由体细胞突变而成，每个肿瘤细胞都可以无限制地生长，但这并不能完全解释其无限增殖的能力。有研究表明，肿瘤细胞中只有一小部分细胞才能在移植后成为肿瘤[2]，这跟干细胞的特性相似。因此，有学者[3]提出肿瘤干细胞理论(tumor stem cell,TSC),该理论认为肿瘤细胞中存在着极少量具有无限增殖能力、可自我更新及多向分化潜能的肿瘤干细胞，对于肿瘤细胞无限增殖、复发和转移提供了理论依据。这一理论也让我们重新认识肿瘤发生和发展，以及对于临床治疗肿瘤提供了新的研究方向和方法。

对于肿瘤干细胞有多种学说来解释来源，但比较认可的有两大观点。其中有一个学说认为, 肿瘤干细胞的起源是由于各种因素的作用下正常干细胞发生的基因突变等等原因所转变而来。因此肿瘤干细胞与正常干细胞的特性特别相似,由同样的信号通路介导细胞自我更新、增殖和分化等等[4]。在一些肿瘤中，一些学者们通过研究也证实了肿瘤干细胞来源于正常干细胞的突变[5]。但还有一种学说认为，肿瘤干细胞来源于祖细胞，祖细胞是一种来源于干细胞的早期分化类型, 相较于干细胞它有更为定向的细胞特征, 比如较低的自我更新能力以及有限的复制性[6]。关于祖细胞的特性, 很多研究显示它可以分化成为肿瘤干细胞。一个正常的祖细胞,经过诱导后可以分化成多种家系的肿瘤干细胞[7]。虽然有多种观点来解释肿瘤干细胞的来源，但不管是从体细胞还是祖细胞来源，两者都有其共同点，都支持肿瘤干细胞可以自我更新及无限增殖。

肿瘤干细胞跟正常干细胞一样都具有自我更新和多向分化的能力[8]。肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发等都有着很重要的作用。肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力，肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能[9]。有研究表明肿瘤干细胞同时也会对放疗或化疗产生耐药性，例如，其可以增强对DNA损伤识别和修复的能力, 从而使其存活，产生化疗抗性[10]。有研究表明肿瘤干细胞可以通过不同机制耐药[11]。常规的肿瘤治疗方法，如化疗只能消灭一小部分肿瘤细胞，然而对肿瘤干细胞的杀伤不足，肿瘤往往在治疗一段时间后复发。因此大部分肿瘤的治疗失败的原因可归咎于肿瘤干细胞的存在。因此未来治疗肿瘤的新方向是找到肿瘤干细胞特异性治疗靶点。

1.2 喉癌肿瘤干细胞的研究现状

肿瘤干细胞最早在白血病的研究中发现[12]，而后在许多恶性肿瘤中都相继发现了肿瘤干细胞的存在，如在喉癌细胞中证实了喉癌干细胞的存在[13]。喉癌肿瘤细胞中的喉癌干细胞数量很少，但其却是喉癌复发、转移甚至耐药的主要原因，对于喉癌干细胞主要的研究方向是对其表面标志物或通过其相关信号通路来达到抑制喉癌干细胞的目的。因此对喉癌干细胞的研究有助于治疗或预防喉癌。有研究团队通过研究以Hep-2 喉癌细胞系及喉鳞状细胞癌实体瘤为研究对象，研究喉癌干细胞的生物学特性及自我更新机制。研究并首次证实了喉癌组织细胞中，CD133+Hep-2 细胞具有强的增殖、侵袭能力及克隆形成能力，对放化疗有抵抗性，具有干细胞特性[14]；CD133+肿瘤干细胞中，抗凋亡基因表达上调，是CD133+Hep-2 细胞自我更新的物质基础，干细胞相关信号通路Wnt、Hedgehog 以及Bmi-l 信号通路处于活化状态，靶向这些信号通路，有望有效杀伤喉癌干细胞,在喉癌实体瘤干细胞中，Bmi-1 通过抑制下游INK4a/ARF 基因转录及P16ink4a/P14ARF 蛋白表达调控喉癌实体瘤干细胞自我更新，Bmi-1 基因有望是喉癌干细胞靶向治疗新的位点[14]。

研究中发现喉癌干细胞的表面标志物有CD133[13]、CD44[15]、ALDH-1[16,17]等。有研究表明这些标志物对肿瘤信号转导、肿瘤免疫逃逸、药物耐受和放疗抵抗均有相关性[18]，这些标志物有可能成为新的喉癌干细胞治疗靶点。有研究表明RNA 干扰TRAP1 表达抑制CD133～+CD44～+喉癌干细胞生长并促进凋亡[19]等。

喉癌干细胞的形成及转化是多种信号通路共同作用的结果。喉癌自我更新相关的Hedgehog 信号通路、Wnt 信号通路及Bmi-l 通路[14]。因此寻找有效的信号通路，并通过其抑制喉癌干细胞是一大研究热点。例如，RGD 肽可以通过抑制VEGF 介导的STAT3/HIF-1α 通路而抑制喉癌干细胞[20]。或者通过某一信号通路来增强药物发挥的功效，例如顺铂在很多肿瘤包括喉癌都有作用，而有研究发现IL-6 的核糖核酸干扰抑制通过下调IL-6/STAT3/HIF1 通路增强顺铂在喉癌干细胞中的功效[21]。

在喉癌干细胞的研究中，不论通过发现喉癌干细胞的表面标志物，进而识别标志物再达到精准的靶向治疗，还是通过其信号转导通路来直接抑制喉癌干细胞或增强药物的功效都是我们取得的一些成果。

2 外泌体

2.1 外泌体概念

外泌体是起源于核内体、大小为 30 ～ 100nm 的细胞外囊泡,最早在研究网织红细胞成熟为红细胞过程时发现了外泌体[22]，不过当时人们认为外泌体的作用只是将代谢垃圾从细胞内运出细胞外而未给予足够的重视。直到1996 年,Raposo等人发现外泌体具有呈递抗原,并刺激T 细胞增殖的作用[23],而受到关注并开始研究。

外泌体内包含有许多的生物活性物质，如蛋白、核酸及脂类等[24]。除了某些特殊的细胞外几乎所有细胞都释放外泌体，,包括血液、唾液、尿液、脑脊液等[25]体液中广泛存在。外泌体作为细胞间物质交换的载体，介导细胞-细胞间通讯，参与机体各种生理及病理过程[24]，对生物有重要的生理意义。

2.2 外泌体的提取及生物特性

外泌体可携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程[26]。而来源于不同细胞的外泌体其对受体的作用也大有不同，在机体内可发挥不同的作用。例如，研究表明外泌体不仅在正常细胞内发挥作用也会对肿瘤细胞的生长发育产生影响[27]。有研究表明外泌体与靶细胞的识别具有特异性，如血小板来源的外泌体能识别内皮细胞和巨噬细胞，不能识别中性粒细胞[26]；而中性粒细胞来源的外泌体则可识别血小板、巨噬细胞及树突状细胞等[26]，而这对利用外泌体来研制靶向药物提供了可能性。对外泌体的提取中仍没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性等[26]。如何开发高效、快速、稳定, 并且能完整保留其结构和生物功能的方法, 是目前外泌体能应用于临床的基础及前提,目前常用的提取方法一般有离心法、超滤法、免疫法、沉淀法等[28]。

2.3 外泌体与喉癌肿瘤干细胞

2.3.1 外泌体与肿瘤干细胞

外泌体在肿瘤诊断和治疗上也有很大的作用。而且同细胞分泌的外泌体的功能不尽相同，使用不同细胞来源外泌体诊断或治疗疾病及肿瘤被广泛研究，如，间充质干细胞外泌体增强牙周韧带细胞功能促进牙周再生[29]。尿外泌体在肾脏疾病中的研究[30]、外泌体在心血管疾病方面的研究[31]等。利用不同来源外泌体诊断治疗肿瘤是最近的研究热点。除了利用外泌体本身之外，有研究表明，依靠外泌体的特性, 可将外泌体作为一种载带核酸、化学、蛋白质类药物的载体[32]。相关的研究中已经表明此种方法的可行性。近年来, 在肿瘤靶向治疗中，由于外泌体来源广泛、纳米尺寸和良好的生物相容性，许多研究人员成功地从不同细胞中构建了作为治疗性载体的一种靶向治疗方式[33]。不论使用外泌体本身的特性还是改造外泌体作为载体治疗疾病都是未来的研究方向。

肿瘤细胞自身也可分泌外泌体，并进入机体发挥双向调控作用，不仅促进肿瘤发生发展，同时对其发生及发展也可产生抑制作用。其外泌体及其分泌的各种生物学物质，均可在肿瘤细胞的发生发展过程中起重要的生理作用。例如，在肿瘤发生、发展、转移、恶化和免疫逃逸过程中起到很重要的作用[34]。

有学者发现肿瘤细胞来源的外泌体对肿瘤生长具有促进作用[35,36]。一项研究报道中，给予预先种植卵巢癌细胞的小鼠的腹腔内注射从卵巢癌患者腹腔积液中分离出的外泌体，可以明显促进小鼠腹腔内肿瘤的生长[35]。而肿瘤分泌的外泌体促进肿瘤生长是通过不同的途径来进行的，如乳腺癌外泌体通过抑制NK 细胞功能促进肿瘤生长[36]等。外泌体不仅对肿瘤有促进作用，也有抑制作用。有研究表明间充质干细胞来源的外泌体可以抑制肿瘤的增殖，例如来自骨髓间充质干细胞的外泌体含有促进转移性乳腺癌细胞休眠的microRNA[37]。

肿瘤外泌体能促进肿瘤的转移，在肿瘤的转移中通过不同的途径发挥着其独特的作用。肿瘤外泌体内含的多种物质对肿瘤的转移有一定的影响。有研究表明来自高转移细胞的外泌体miRNA 可诱导低转移细胞的转移[38]。同时肿瘤干细胞外泌体可以通过促进间充质干细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为来促进肿瘤远处转移[39]。近来研究中发现外泌体在肿瘤的上皮间质化过程中可以起到一定作用[40]，而上皮间质化在肿瘤的转移的过程中发挥着重要作用。总之，不同来源外泌体包括肿瘤来源外泌体在各种不同肿瘤中的作用有待进一步的深入研究。

2.3.2 外泌体与喉癌肿瘤干细胞

外泌体与肿瘤干细胞包括喉癌干细胞，既有促进也有抑制的作用。同时肿瘤干细胞自身也会分泌外泌体，对肿瘤细胞产生调控作用如高表达ANXA2 的肝癌干细胞的外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性具有调控作用[41]。同时其对肿瘤干细胞自身或肿瘤细胞产生双向的调控作用。例如，有研究表明肿瘤样干细胞Piwil2-iCSC 外泌体能促进人脐带间充质干细胞的增殖、迁移及侵袭[39]。而在抑制性作用方面，喉癌Hep-2 细胞来源外泌体能成为树突细胞（DC）并刺激T细胞增殖而抑制喉癌细胞生长[42]等。喉癌细胞或喉癌干细胞来源外泌体其内部富含丰富的信息物质包括癌细胞信息，如mRNA、miRNA 等，这让其成为新的喉癌肿瘤标记物成为可能，当其被分泌到体液中时可通过对其检测得到一定的肿瘤信息。例如Joseph 等[43]研究使用表面增强拉曼光谱法对外泌体进行分析检测胰腺癌。还有研究表明可通过直接评估外泌体的蛋白质含量来区分具有不同上皮和间充质表型的乳腺癌亚型[44]。也有研究表明对喉癌患者血清中外泌体miRNA-21 和HOTAIR 的检测可以作为喉癌患者诊断的标志物[45]。同时外泌体因其生物特性可以成为药物载体，在靶向治疗中发挥作用。例如，外泌体可以装载siRNA,miRNA,相关蛋白以及小分子化合物等,具有抗肿瘤特性外泌体被传递到靶组织发挥治疗作用[46]。有研究通过外泌体较高的血清稳定性、毒性低、易通过各种屏障、较高的生物相容性和较低的免疫原性等特性治疗乳腺癌[47,48]，进一步研究发现载药肿瘤细胞外泌体对CD133+乳腺癌肿瘤干细胞具有一定的抑制作用[49]。而CD133+也是喉癌肿瘤干细胞标志物质之一，肿瘤细胞外泌体对喉癌肿瘤干细胞是否有抑制作用有待于进一步的研究。综上所述，对外泌体进行一定的改造或可以成为喉癌治疗的重要靶点和工具。

目前肿瘤干细胞和外泌体的研究已经取得了一些成果，例如发现外泌体对肿瘤干细胞的调控作用，或者通过对外泌体的检测来达到对肿瘤的检测，如检测外泌体miRNA-21 和HOTAIR 的检测以发现喉癌[45]等。来源不同的外泌体的功能也不尽相同，因此许多研究者致力于研究来源不同的外泌体的功能及其在可以肿瘤中发挥的作用。例如由肿瘤干细胞来源的外泌体对自身肿瘤的调控作用和外泌体跟肿瘤干细胞之间相互平衡的关系同样也是研究的热点。对于外泌体和肿瘤干细胞之间更深入相关性有待于进一步的研究。

3 总结

近年来，对肿瘤干细胞和外泌体的研究日益增多，对于外泌体的生物学作用及其在肿瘤的发生发展中作用的研究取得了一定的进展。几乎所有细胞包括肿瘤干细胞都会分泌外泌体，对外泌体的检测或可以成为新的肿瘤标志物检查方法，对肿瘤的早期发现、诊断和治疗有重要意义。而外泌体不仅对肿瘤的发生和发展有促进作用也有其抑制的作用。外泌体可以对肿瘤的治疗提供新的靶点和诊疗思路，而肿瘤干细胞对肿瘤的发生发展有着重要的意义，研究肿瘤干细胞和外泌体的相互作用，利用外泌体本身或其他方法去治疗肿瘤是研究的热点之一。目前外泌体已经在多种疾病的检测及治疗中都发挥了重要作用。虽然外泌体很有研究价值，但对于任何一种新的事物我们都应该更加的慎重，严格对其验证和测试，应对外泌体进行更多更深入的研究。