全自动SPE-LC-MS/MS 法测定鸡蛋中的多种兽药残留

常晨阳，韩焕美，潘迎芬，单娇，朱秀焕，刘伟

(1.聊城海关 山东聊城 252200；2.济南 海关济南 252000；3.东山海关 福建漳州 363401；4.黄岛海关 山东青岛 266500)

由于养殖户在饲养过程中兽药使用不规范或不科学等问题，鸡蛋中兽药残超标事件经常被报出[1]，目前国标对鸡蛋中兽药残留的检测方法是对不同种类兽药分别检测[2]，操作复杂、耗时费力。本研究以鸡蛋日常风险监测中高风险的喹诺酮类、磺胺类、四环素类、抗病毒类、聚醚类抗生素、硝基咪唑类、抗球虫药类、大环内酯类8 大类共31 种兽药为检测对象，优化鸡蛋中兽药残留的提取净化方法，应用全自动固相萃取SPE 代替传统的人工固相萃取操作，使得操作简单省时[3]。联用可实现高灵敏度、高通量检测的高效液相色谱-三重四级杆质谱仪LC-MS/MS[4]，建立了鸡蛋中多种兽药残留的同时检测方法，为鸡蛋样品的药残风险监控提供新的技术手段，同时为蛋鸡养殖业科学用药提供技术参考。

1 试验方法

1.1 标准工作曲线的制备

首先分别准确称量约10mg 固体标准品，于100mL 容量瓶中用乙腈定容，配制100μg/mL 浓度的单标储备液，然后根据待测的线性范围配制不同浓度的标准中间液，吸取一定量体积，用阴性鸡蛋样品基质提取液制备混合标准浓度系列。

配制喹诺酮类（氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、达氟沙星、氟甲喹）的线性范围为5～100μg/kg、磺胺类（磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺甲噁唑、磺胺喹噁啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺多辛）为10～200μg/kg、四环素类（土霉素、四环素、金霉素）10～200μg/kg、抗病毒类（金刚烷胺）1～100μg/kg、聚醚类抗生素（盐霉素）10～200μg/kg、硝基咪唑类（洛硝哒唑、甲硝唑、异丙硝唑、二甲硝咪唑、羟基甲硝唑）0.5～100μg/kg、抗球虫药类（氯羟吡啶）5～100μg/kg、大环内酯类（替米考星、竹桃霉素、红霉素、交沙霉素）1～100μg/kg。

1.2 提取溶液的配制

提取溶剂为0.1mol/L 的Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲液，配制方法为：称取37.2g 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-2Na）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）10.9g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）12.9g，用水溶解后稀释于1,000mL 容量瓶中定容，之后用1mol/L NaOH 溶液调pH 至4.0。

1.3 样品前处理

1.3.1 预处理取新鲜鸡蛋样品，去壳取可食部分在高速匀浆机中充分搅拌均匀，置于干净容器中密封保存，4℃冰箱冷藏备用。

1.3.2 提取准确称取预处理后的鸡蛋样品1.0g（精确到0.01g）于50mL 离心管中，加入10mL 1.2 的提取溶液，涡旋混匀后，超声提取5min，10,000r/min 离心2min 后，转移出上清液至新的离心管中，再吸取10mL 提取溶液按上述操作重复提取一次。合并两次提取上清液，加入5mL 正己烷，涡旋1min 后，10,000r/min 离心2min，取下层清液经固相萃取净化。

1.3.3 净化在全自动固相萃取仪工作站上设置洗脱程序，使用亲水亲脂共平衡聚合物基体反相InertSep HLB（200mg/6mL）固相萃取小柱净化待测目标物。程序设定见表1。

表1 全自动固相萃取仪设定洗脱程序

1.3.4 浓缩上机将1.3.3 中收集的洗脱液于38℃下氮吹至近干，用10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液定容至1mL，涡旋混匀后，过0.22μm PTFE 滤膜，经高效液相色谱质谱联用仪分析。

1.4 高效液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack GISS C18（100×2.1mm，2μm）；流速：0.4mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃；流动相：A 0.1%甲酸水，B 甲醇；梯度洗脱程序：0～1min,10%B；1～3min，10%B→50%B；3～6min，50%B→70%B；6～8min，70%B→90%B；8～11min，90%B；11～11.5min，90%B→10%B；11.5～13min，10%B。

1.5 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源ESI，正离子模式；扫描模式：多反应监测MRM；接口温度：300℃；DL 温度：260℃；加热模块温度：400℃；碰撞气：高纯氩气（≥99.999%）；加热气：氮气10L/min；雾化气：高纯氮气3.0L/min；干燥气：氮气10L/min。各化合物的母离子、子离子、碰撞电压参见国标。

2 结果与分析

2.1 提取溶液的选择

提取溶液要考虑鸡蛋基质本身富含蛋白质和脂肪的特点，同时兼顾待测31 种性质存在差异的兽药分子的回收效率。Mcllvaine-Na2EDTA 缓冲液中的柠檬酸盐溶液在提取多种有机物分子的同时能够很好的沉淀蛋白；其中的EDTA-Na2可以络合溶液中金属离子，显著提高四环素类药物的回收率；正己烷的脱脂操作，可进一步降低鸡蛋中脂类干扰。

2.2 全自动固相萃取仪的优势

固相萃取是农兽残提取中最常用到的净化方式[5]，可显著降低基质效应。但是操作步骤多、比较耗时。全自动固相萃取是近年来兴起的一种自动化前处理设备，且全封闭式操作减少污染的风险，使的操作更简便、可靠。本实验对比全手动过柱操作、带空气泵的半自动过柱和全自动固相萃取三种操作方式，统计人工操耗时、回收效率（以氧氟沙星数据为例），数据见表2，可见全自动固相萃取可减少手动工作，尤其在处理多个样品时，可明显提高工作效率，且因人为误差减少，RSD 值更小，回收率稳定重复性更好。

表2 手动、半自动、全自动固相萃取过柱方式比较

2.3 实验方法学验证

通过参考GB 31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》，配制31 种兽药的线性范围，线性相关系数R2均大于0.99。1.1 中所配标准曲线的第一个点的信噪比（S/N）均大于10，符合最低定量限要求。通过阴性鸡蛋样品进行5μg/kg 和50.0μg/kg 两个浓度水平加标，按照1.2.1 经前处理上机检测，每组平行6 份样品，考察回收率和相对标准偏差RSD。具体结果如下：5μg/kg 加标浓度的加标回收率69.5%～110.2%，RSD 为0.95%～10.4%；50μg/kg 加标浓度的加标回收率为72.4%～106.1%，RSD 为0.45%～11.8%，符合国标GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中对回收率和标准偏差的要求，满足定性和定量检测要求。

2.4 实际样品测定

从超市、农贸市场、养殖户等不同渠道购买抽样，累计对60 批次鸡蛋中31 种兽药进行高通量测定，二批次检出阳性结果。一批次检出氧氟沙星6.34μg/kg，一批次检出磺胺间甲氧嘧啶20.1μg/kg，金刚烷胺17.6μg/kg。用国标方法GB/T 20366—2006、GB/T 21316—2007、GB31660.5—2019 对样品进行复检，阳性检出项目一致，数据见表3，检出量偏差小于5%，进一步验证了该方法的准确性。

表3 实际样品检测结果与国标方法对比（μg/kg）

3 结论与展望

在鸡蛋中检出的兽药残留有违规使用兽药、不遵守休药期规定等多方面原因。高通量检测相对于单项目检测，可大幅提高检测速度，节约检测资源和成本，是实现快速检测需求的重要方式。

本方法结合鸡蛋样品的特点，将可实现净化过程自动化操作的全自动固相萃取仪和高检测灵敏度的液相色谱三重四级杆质谱仪联合应用，成功实现鸡蛋中喹诺酮类、磺胺类、四环素类、抗病毒类、聚醚类抗生素、硝基咪唑类、抗球虫药类、大环内酯类、8 大类共31 种兽药残留的高通量同时检测，该方法操作简单、前处理自动化程度高，定量准确，重复性好，既可满足日常检测需要，又为鸡蛋药残风险监控、蛋鸡养殖期安全用药提供有力的技术支撑。