鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

周燕子，王敏存，贺玉婷，李海英，陈定芳，潘 雪，周逸群*，贺福元, 3*

鱼腥草挥发油体外代谢通用客体“印迹模板”研究

周燕子1, 2，王敏存1, 2，贺玉婷1, 2，李海英1, 2，陈定芳1, 2，潘 雪1, 2，周逸群1, 2*，贺福元1, 2, 3*

1. 湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208 2. 中药成药性与制剂制备湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208 3. 湖南中医药大学 中医药超分子机理与数理特征化实验室，湖南 长沙 410208

基于体外代谢模型对鱼腥草挥发油代谢产物通用客体“印迹模板”进行研究。自制鱼腥草注射液（Houttuyniae Injection，HI），将其在大鼠肝微粒（RLM）中进行孵育，于不同时间点采集样本，进行GC-MS测定；计算所有代谢产物的分子连接性指数（MCI），并从中筛选出代谢产物的共有成分和非共有成分，总结其结构特点，运用夹角余弦法计算相似度；将所有代谢成分进行归类。共得到鱼腥草挥发油代谢产物62个，其中共有成分6个，分别是十四烷、植烷、正癸酸、己酸、乙酸异龙脑酯和正己醇，除乙酸异龙脑酯外，MCI与总体代谢产物相似度较高（0.914～0.964）。将非共有成分归类得到6个成分群，其平均MCI与总代谢产物MCI的相似度均较高（0.939～0.999），然而各个成分群之间的平均MCI相似度差异显著。以超分子“印迹模板”为理论指导，为鱼腥草挥发油代谢产物进行了归类。采用分子连接性指数和夹角余弦法，表征了鱼腥草挥发油代谢通用客体“印迹模板”。

鱼腥草挥发油；代谢产物；超分子；印迹模板；分子连接性指数；GC-MS；体外代谢；通用客体；鱼腥草注射液

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜Thunb.的新鲜全草或干燥地上部分，始载于《名医别录》。作为广泛应用的传统中药，具有清热解毒、消肿疗疮、利尿除湿的功效。现代研究发现其主要化学成分为挥发油类、黄酮类、有机酸、脂肪酸、氨基酸以及生物碱类成分[1]。其中挥发油类成分为主要药效成分，其鲜草含挥发油0.049%，主要有鱼腥草素，即癸酰乙醛、癸醛、月桂醛及甲基正壬酮等成分[2-6]。

临床上曾广泛应用的鱼腥草注射液（Houttuyniae Injection，HI）是从鲜鱼腥草中用水蒸汽蒸馏法提取的挥发油类成分[7]，加入增溶剂聚山梨酯-80及氯化钠调节为等渗溶液，滤过后灭菌而成，具有抗菌、抗病毒以及增强机体免疫力的药理作用，用于治疗上呼吸道感染、急性化脓性扁桃体炎、急性慢性支气管炎、肺炎等呼吸道疾病、尿道炎、肾盂肾炎等泌尿系统疾病以及各种皮肤感染等疾病[8‑10]。鱼腥草的有效成分为挥发油，是多成分体系[11‑13]。目前，关于鱼腥草挥发油的代谢产物鲜有报道，且没有将这些代谢产物进行归类总结。

超分子化学，即“超越分子的化学”，由J M Lehn提出，是分子间键的化学，涵盖由两个或两个以上化学成分缔合形成的实体的结构和功能，用于研究分子自识别、自组装等现象[14]。中药超分子化学理论认为，中药与人体均为自然界生物超分子体，其药效基础为生物超分子“印迹模板”的聚集体，进入人体后按超分子自主印迹行为发挥药效作用[15]，代谢产物也同样适用[16]。“印迹模板”理念起源于Fischer的酶与底物作用的“锁钥模型”及Pauling的“抗体-抗原”学说，可解释配体-受体理论，属超分子化学中主-客体化学研究范畴，具自组装、自组织、自识别与自复制的特点[17]。“在空间结构和结合位点上能完全匹配的模板物”即为超分子“印迹模板”，对中药成分来说既是其分子结构的空间活性结构，也可以说是活性原子团的空间排列点阵，据此可从化学物质的本源上阐明主-客体分子自主作用的普遍规律。

因此，本实验通过自制HI，首次研究HI中的挥发油在大鼠肝微粒体的代谢产物及其特点，以超分子“印迹模板”为理论[16,18‑20]，结合分子连接性指数（MCI）[21]，探索其代谢通用客体的“印迹模板”规律，对指导鱼腥草临床合理用药及其配伍具有重要意义，为中药代谢产物“印迹模板”的研究奠定基础。

1 材料

1.1 药品与试剂

新鲜鱼腥草8批，购于湖南中医药大学含浦校区周边村庄或菜市场，按照采购时间批次编号依次为YXC01～YXC08，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定为三白草科蕺菜属植物蕺菜Thunb.的新鲜全草。

对照品甲基正壬酮（批号110834-200502，0.1 mL，GC测定质量分数≥98%）、正十五烷（批号11677-200401，100 μg/mL）、乙酸龙脑酯（批号110759-201105，0.2 mL，GC测定质量分数≥97%）及α-蒎烯（批号897-2000001，1 mg，GC测定质量分数≥98%）均购自中国食品药品检定研究院；正已烷，批号K46764991524，色谱纯，购自德国默克股份有限公司；KH2PO4、K2HPO4、KCl、乙二胺四乙酸（EDTA）、甘油、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-P-DH）、MgCl2、(NH4)2SO4均购自Sigma公司；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.2 动物

雄性SD大鼠，SPF级，体质量200～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。本研究依照湖南中医药大学伦理委员会的要求执行，动物实验经湖南中医药大学伦理委员会批准（伦理编号：LLBH- 201107230003）。

1.3 仪器

CM-230超纯水系统，北京帕思特科技有限公司；GCMS-QP2010型气质联用仪，日本岛津公司；CP-114电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；98-1-B型电子控温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司；1000 μL和100 μL移液枪，济南好来宝医疗器材有限公司；20 mm球形冷凝管，天津市奥淇洛谱商贸有限公司；500 mL挥发油提取器，天长市吉高实验设备有限公司。

2 方法

2.1 HI样品制备

取新鲜鱼腥草全株，除去泥沙、根及烂叶，称取2000 g，用剪刀剪碎成2～3 cm的小段，置于单口圆底烧瓶中加水浸没药材。水蒸气蒸馏，收集初次蒸馏液2000 mL，再进行重蒸馏，收集重蒸馏液约1000 mL，加入7 g氯化钠及5 g聚山梨酯-80，混匀，加注射用水使成1000 mL，使用0.45 μm和0.22 μm的滤芯进行滤过，灌封，115 ℃灭菌30 min，即得HI。

2.2 肝微粒体实验溶液配制

2.2.1 PBS液配制 精密称取KH2PO4、K2HPO4、KCl粉末分别配制成1 mol/L的溶液，并配制EDTA饱和溶液（100 mmol/L），用移液管量取40.1 mL K2HPO4溶液，9.9 mL KH2PO4溶液，60 mL KCl溶液，5 mL EDTA溶液，加水至500 mL，调整pH值为7.4，即得PBS液。

2.2.2 G.S（800 mL）系统溶液的配制 将NADP、G-6-P、G-6-P-DH、MgCl2、(NH4)2SO4分别配制成65 mmol/L、165 mmol/L、500 U/mL、165 mmol/L、2.6 mol/L的溶液，向离心管中分别加入去离子水528 µL，G-6-P溶液80 µL，G-6-P-DH溶液32 µL，NADP溶液80 µL，MgCl2溶液80 µL，配制成G.S（800 mL）系统溶液。

2.3 大鼠肝微粒体制备

实验前大鼠控制饮食1周，并于实验前禁食不禁水24 h。将大鼠固定在木板上，并用细线把大鼠四肢及头部固定。用剪刀将大鼠腹部打开，快速找到肝脏；用另一把消毒冷藏过的剪刀将肝脏整个剪下来，不能带有除肝脏外的其它任何部分，用冰水洗净，称定质量。按1∶4比例（1 g肝组织、4 mL PBS液）将肝组织研碎，倒入50 mL离心管，以9000×、4 ℃离心20 min后快速取上清，再以恒温4 ℃、100 000×离心90 min，取下层粉红色沉淀，即为大鼠肝微粒体，按照体积比1∶3向肝微粒体中加入储存液（750 mL PBS，250 mL甘油）后，分装于离心管中−80 ℃下保存备用。

2.4 孵化反应

向管中加入25 μL HI（空白组加蒸馏水），40 µL的磷酸盐缓冲液（pH值7.4），20 µL肝微粒体和60 µL双蒸馏水，37 ℃恒温水浴锅预孵化10 min。加入G.S液启动反应，并继续在37 ℃孵育，于10、30、45、60、75、90、120、150 min取样品。平行3组进行实验。

2.5 体外代谢样品的制备

在样品中加入22.0 μg/mL正十五烷（内标），用800 μL氯仿-异丙醇（9∶1）萃取，涡旋振荡1 min，3000 r/min离心10 min，取上清液进行GC-MS测定。

2.6 GC-MS分析条件

2.6.1 气相色谱条件 色谱柱为石英毛细管柱Rtx-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初温为60 ℃，以2 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，再以10 ℃/min升至200 ℃，保持9 min；分流比30∶1；载气为高纯He（99.999%）；载气流量为1.0 mL/min；气化室温度为250 ℃。

2.6.2 质谱条件 离子源为EI源；离子源温度为230 ℃；四级杆温度为150 ℃；电子能量为70 eV；接口温度为280 ℃；溶剂延迟2.5 min；质量范围为/40～500。

3 结果

3.1 鱼腥草挥发油代谢产物信息

根据GC-MS结果，只采用2组理想的实验数据进行展示并分析。扣除空白溶剂峰，整理得到每个时间段各个峰的峰面积以及频数，共得到鱼腥草挥发油代谢产物62个，结果见表1，其中S1、S2来自YXC01，S3、S4来自YXC02，S5、S6来自YXC03，S7、S8来自YXC04，S9、S10来自YXC05，S11、S12来自YXC06，S13、S14来自YXC07，S15、S16来自YXC08。

3.2 鱼腥草挥发油代谢共有产物

将频数≥15（90%批次数，本实验批次数为16）的成分视为共有成分，共得到6个共有成分，按相对质量分数从高到低排序分别为十四烷（7.15%）、植烷（6.65%）、正癸酸（3.10%）、己酸（0.41%）、乙酸异龙脑酯（0.18%）、正己醇（0.13%），且大都为简单直链结构，由芳香环、酯类等复杂的结构经过肝微粒酶代谢转化而来。由表2可得，共有成分的保留时间分布大致均匀。本实验只展示MCI零阶、一阶和二阶的值。采用夹角余弦法计算相似度，得到共有成分的MCI与总代谢产物相似度普遍较高，可以代表鱼腥草挥发油总代谢产物的“印迹模板”。乙酸异龙脑酯的相似度较低，可能是由于乙酸异龙脑酯具有较复杂的带环立体结构，观察各个成分结构可知，大致包含烷烃、醇类、酯类、醛酮类等成分，且结构较为简单。众所周知，MCI值与分子拓扑结构有关，分子结构的细微差异，会在MCI各阶出现相应的变化，这可能是导致乙酸异龙脑酯MCI相似度较低的原因。

表1 各组鱼腥草挥发油代谢产物的峰面积及频数

续表1

编号tR/min峰面积频数S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S164129.242147 0560269 38115 143 2530619 012000000304 4760171 0810 64229.642823 180257 4102 631 45031 385 948000969 690071 038189 771712 808197 20385 08600104331.2426 782 1263 050 5384 566 61376 209 750706 0154 088 110015 355 377724 2122 781 7423 609 3404 231 8781 823 9883 222 7431 237 9971 323 433154431.642522 86408 177 3710625 72804 367 74630 790 6342 325 9355 358 9104 219 42102 454 4524 410 6332 278 2573 192 034124532.0427 124 6171 637 4063 024 53703 292 51713 868 02212 738 63427 412 5650488 3745 286 43703 321 8384 327 42447 04745 298134632.8422 128 340431 3125 583 758202 312 7034 205 0519 691 520043 086 5341 487 725355 6561 021 72612 585 6814 364 4337 851 8302 796 0341 466 327154733.2421 225 79770 0403 118 86201 238 5542 764 3431 266 07846 507 14312 177 684896 1673 898 292003 202 649656 344531 384134833.642298 647106 909807 090001 911 733630 23941 174 83616 835 093431 6781 892 1112 364 2711 908 99200192 932124934.042304 65161 131852 348000600 00855 418 93523 411 865002 313 7501 279 3302 112 507400 28260 571115034.842366 89857 4951 130 8870000104 253 61243 907 50400932 52200044 357 75135.6421 326 123100 9474 608 82600268 1581 068 84883 013 06842 500 233654 8892 334 305618 77218 718 216556 044200 0980135236.0425 150 505795 10218 030 606001 427 066433 34556 652 99884 425 233250 151817 2061 813 49841 899 0291 192 12900125336.442987 566239 7675 237 69901 929 2316 797 2673 303 876124 623 44287 084 3942 682 97810 504 098727 81931 524 892978 5141 334 949603 473155436.8423 640 215143 6350893 962 6107 145 66601 159 07856 845 49858 655 234642 1953 470 8686 094 001121 897 6445 720 950770 615216 404145537.6421 050 463342 8293 920 01500823 245379 119165 268 62498 446 60486 75902 860 9834 077 0353 374 78638 9330125638.0422 060 478364 7335 775 607001 461 4861 382 774136 577 372128 137 289536 1433 533 7861 056 30501 588 977221 089154 570135740.8421 465 773535 8868 732 611001 393 0331 574 455001 432 9765 410 457000135 299677 329 95841.242072 4320453 116604 9603 721 5121 069 264001 283 2157 734 5062 007 08803 585 6880865 634105941.6423 248 15848 13218 068 28400000001 965 9161 483 664764 9142 687 221497 2431 336 963 96042.042716 160123 8943 324 3510636 8922 764 5751 668 437004 017 42010 793 550272 416700 0562 577 210353 1763 310 469136144.442256 58902 821 955001 509 880154 552000902 6133 534 5640711 032145 870137 757 96244.84200000524 8750000100 57700286 95900 3