鸭圆环病毒PCR检测方法的建立与应用

李金平，张富友，朱峻锋，张 琳，刘 朔，彭 程，蒋文明，刘华雷

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.山东农业大学，山东泰安 271018；3.青岛农业大学，山东青岛 266109）

鸭圆环病毒（duck circovirus，DuCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，无囊膜，为单股、环状、双向DNA 病毒，呈二十面体对称[1]。在电镜下，其病毒粒子大小与其他圆环病毒类似，直径为15～16 nm。Hattermann 等[1]于2003 年首次报道DuCV 感染；2006 年和2008 年，我国分别在台湾地区和大陆检测到DuCV。目前，DuCV 在世界主要养鸭区流行较为普遍[2-6]。

我国是养鸭大国，鸭饲养量占世界的70%以上。流行病学调查[1]显示，DuCV 在我国鸭群中普遍存在，可以感染各个品种的鸭子，包括樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭等多个品种。该病一年四季均可发病，无明显季节性，主要表现为发育状况差、羽毛营养失调、生长迟缓或停滞。DuCV 感染鸭群后易诱发群体免疫抑制，使鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭传染性浆膜炎、鸭巴氏杆菌病、大肠杆菌病等鸭常见病的发病率上升并加重此类疫病的致病性，导致感染鸭群出现病原的多重混合感染（或继发感染），是我国鸭群流行的主要免疫抑制病病原。

对DuCV 全基因组遗传进化分析发现，DuCV可分为DuCV-1 和DuCV-2 两种基因型[7]。本研究根据DuCV-1 和DuCV-2 的基因组保守区序列特征，建立仅需1 对PCR 引物即可同时检测DuCV-1 和DuCV-2 的PCR 方法，以期减少检测工作量，为进一步开展DuCV、诊断和流行病学调查提供新的检测手段。

1 材料与方法

1.1 病料及病毒株

临床发病鸭组织病料（20 份），采自山东潍坊、济宁、聊城、临沂等地的樱桃谷鸭养殖场；禽流感病毒（H5N6 亚型DK/SD/WF/2019、H9N2亚型DK/SD/LY/2019）、鸭坦布苏病毒（DK/SD/814/2019）、禽腺病毒（C4 血清型DK/SD/LY/2020）、鸭呼肠孤病毒（DK/SD/YN10/2020）以及鸭细小病毒（DK/SD/LY/2017），均由本实验室从临床病例中分离保存。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA 核酸纯化试剂盒，购自旭基公司；2×TaqPlus Master Mix、HiScript II One Step RT-PCR Kit，购自Vazyme 公司。

1.3 遗传进化分析

下载GenBank 数据库中登录的130 条DuCV全基因组序列，利用MEGA5软件进行遗传进化分析。

1.4 序列比对及引物设计

利 用MegAlign 软 件 对DuCV 全 基因组序列进行比对，选择两个基因型DuCV 共同保守区设计3 对引物（F1/R1：5'-CCTTGAGGAGTCGCTGGGAGGA-3'/5'-CCACGCCCAAAGATAACATAAGTC-3'；F2/R2：5'-ACCGGCGCTTGTACTCCG-3'/5'-CCACGCCCAAAGATAACATAAGTC-3'；F3/R3：5'-TTGAGGAGTCGCTGGGAGGA-3'/5'-GACGACTACGTCATTTCCCG-3'），对两个基因型均分别扩增228、476、410 bp。

1.5 PCR 检测方法建立

根据病毒DNA/RNA 核酸纯化试剂盒操作说明书，提取已知DuCV 阳性鸭病料核酸，然后用无核酸酶水作10 倍倍比稀释。利用倍比稀释的核酸模板对设计的3 对引物进行筛选评估。采用25 μL PCR 反应体系：2×TaqPlus Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 倍倍比稀释的核酸模板3 μL，水7.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；最后72 ℃延伸5 min。经Qiagen QIAxcel 毛细管电泳分析后，对PCR 产物进行胶回收，然后送青岛志远生物工程有限公司测序。

1.6 特异性检测

提取禽流感病毒（H5N6、H9N2）、鸭坦布苏病毒、禽腺病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒基因组作为检测模板，以DuCV 核酸为阳性对照，利用建立的PCR方法分别检测上述常见鸭病病原，评估该方法的特异性。

1.7 敏感性检测

测定核酸浓度，将提取的核酸用无核酸酶水作10 倍倍比稀释。利用引物对F3/R3 建立的PCR方法进行检测，评估该方法的敏感性。

1.8 临床应用

使用病毒DNA/RNA 核酸纯化试剂盒，对2020 年收集的20 份临床发病鸭组织样品提取基因组DNA，利用建立的PCR 方法进行检测，并对检测阳性样品进行分析。

2 结果与分析

2.1 DuCV 遗传进化分析

利用MEGA5 软件对GenBank 数据库中的DuCV 全基因组序列进行遗传进化分析。结果（图1）显示，DuCV 可以分为两种基因型：DuCV-1 和DuCV-2，与Zhang 等[4]分析结果一致。

图1 DuCV 全基因组序列遗传进化分析结果

2.2 引物筛选与验证

利用10 倍倍比稀释的核酸模板对设计的3 对引物进行筛选。从图2 可以看出，引物对F3/R3 可以检测到103倍倍比稀释的核酸，敏感性高于引物对F1/R1 和引物对F2/R2，因此选择引物对F3/R3，其位置见图3。

2.3 特异性试验

利用建立的PCR 方法分别对禽流感病毒（H5N6、H9N2）、鸭坦布苏病毒、禽腺病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒核酸进行检测，结果该方法只能对应扩增DuCV 核酸，而对其他病毒核酸扩增均为阴性（图4），表明该方法具有良好的特异性。

图2 引物对筛选结果

图3 引物对F3/R3 的位置

2.4 敏感性试验

从图2 可以看出，利用引物对F3/R3 建立的PCR方法检测下限为1.0 fg/mL（103倍稀释）的核酸。

2.5 临床样品检测

用上述PCR 检测方法对20 份临床发病组织样品进行检测，发现有6 份DuCV 阳性样品（图5）。将阳性扩增产物送青岛志远生物工程有限公司测序，经BLAST 比对发现发病样品中的DuCV 均属于DuCV-1 型。

图4 特异性试验结果

图5 临床样品检测结果

3 讨论

近年来，新的鸭病不断出现，如2010 年左右出现的鸭坦布苏病[8]，2015 年左右出现的鸭短喙侏儒综合征[9]；老的鸭病依然存在，如禽流感、大肠杆菌病、鸭疫里默氏杆菌病等。这些疫病给养鸭业带来了极大挑战。

鸭圆环病毒病是近年来影响养鸭业的一种重要免疫抑制病。该病既可水平传播，又可垂直传播。DuCV 感染后侵害宿主免疫系统，使其免疫力降低，且常与其他病原混合或继发感染，从而加重其临床危害。

遗传进化显示，DuCV 分为DuCV-1 和DuCV-2 两种基因型。这种基于全基因组序列分析的结果与分别基于Cap和Rep基因分型的结果是一致的[10]。为了快速检测DuCV，通过序列比对，本研究选择不同的保守区设计了3 对引物。试验结果表明，引物对F1/R1 和引物对F2/R2 仅能检测到100 倍稀释的核酸（10.0 fg），而引物对F3/R3 可以检测到1 000 倍稀释的核酸（1.0 fg），且引物对F1/R1 出现非特异性扩增，所以本方法选取引物对F3/R3 作为检测引物。该引物对具有良好的特异性，仅能扩增出DuCV-1 和DuCV-2，对H5N6、H9N2、鸭坦布苏病毒、禽腺病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭细小病毒等病毒核酸反应均呈阴性。现有检测方法，多是分别检测DuCV-1 或DuCV-2 的PCR 方法，需要进行两次PCR 反应或多重PCR 才能完成检测[11-12]。而本方法可以同时扩增DuCV-1 和DuCV-2，并进一步通过测序可以区分不同的基因型。临床试验表明，2020 年上半年检测到的6 份DuCV 均为DuCV-1 基因型。本研究建立的DuCV PCR 检测方法，具有特异性强、敏感性高等优点，对于鸭圆环病毒病的流行病学调查、监测、早期诊断和有效防控具有重要意义。