干旱胁迫对桑树叶片氧化损伤及超微结构的影响

任迎虹，祁伟亮，王 飞，刘松青，王 萍，陈卓缘

(成都师范学院 化学与生命科学学院，四川 成都，611130)

桑(MorusalbaL.)为桑科桑属落叶乔木，在我国具有丰富的种质资源，具有较强适应恶劣自然环境的能力和突出的水土保持、绿化美化环境等生态功能，以及具有水果、药用、饲料等较高的经济价值，从而受到广泛的关注[1]。近几年，四川省果桑产业也得到较大规模的发展，如凉山州德昌县，为全国最大果桑生产基地，2015年被中国蚕学会命名为全国第一家“中国果桑之乡”，其辖区内的主要栽培品种德果1号可果、叶兼用，种植面积达5万亩、年产鲜桑椹约6.92万吨、干桑椹约1000余吨、产茧约6.96万担、桑产业助农增收达5.1亿元。但干旱在西南地区发生频率高、持续时间长、波及范围广，严重影响桑叶的产量和品质[2]，严重影响了果桑经济产业发展。因此，针对在干旱胁迫条件下的不同桑树品种的生长状况和品种之间抗旱能力的差异，培育抗旱、高产新品种的研究，便成为桑蚕研究中的重要方向。

植物在受到轻度逆境(干旱、寒冷、水涝等)胁迫时，大多数植物会通过增加或减少渗透调节物质，如可溶性蛋白[3-4]、可溶性糖、脯氨酸[5]等调节细胞渗透势保持一定的膨压，维持植物的形态，对细胞起到保护作用。同时干旱胁迫也会导致植物体内产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，如超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由(HO.)[6-8]，它们性质活跃，具有高反应活性，可通过电子传递或其它代谢途径产生[6-8]。而ROS的产生可能是植物细胞在非生物胁迫和衰老条件下最早的反应之一，在正常条件下，植物细胞中产生的ROS可通过体内抗氧化酶清除系统，从而维持在相对稳定的水平。若植物处于深度的逆境胁迫或者发生衰老时，机体内ROS清除机制功能异常，多种来源的ROS过度积累导致防御系统崩溃、ROS爆发[9-10]。一方面ROS会与磷脂、膜受体蛋白发生脂质过氧化反应产生丙二醛(MDA)，严重破坏膜系统的完整性和流动性[11-12]。另一方面，过量的ROS不但会损伤自身的细胞器，也会损伤周围其他细胞，过量的ROS常常引起叶绿体损伤、线粒体肿胀、染色质凝聚、凋亡体形成[13-16]，最终导致细胞死亡[17]。最初ROS被认为是破坏细胞成分的有毒代谢产物, 但最近许多研究证明，ROS在细胞中可作为信号分子，诱导植物防御基因表达，激活多种包括非酶和酶抗防御机制来应对氧化应激[7-8, 17]完成对逆境胁迫的响应[18]。

本研究选择攀西地区主栽桑树品种湖桑32、德果1号，模拟干旱胁迫条件，分析植物叶片的相对水分亏缺、脯氨酸、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等生理生化指标变化规律；并观察干旱胁迫引起的不同桑品种叶肉细胞中叶绿体、线粒体等超微结构及ROS的差异变化规律。旨在进一步认识干旱条件下桑树的植物学特性、生理生化及细胞学响应特征，为四川西南地区退耕还桑区桑树抗旱育种及品种的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试桑树品种为德果1号，湖桑32号(桑树干旱胁迫常用对照材料)。试验材料均取自于德昌县桑树种质资源圃。选取长势一致的幼苗种植到装有营养土(营养土∶珍珠岩=1∶1)的10 L塑料盆中，每盆栽植4株幼苗，温室自然光照下培养3个月(温度为25℃，湿度为20%～30%，株高约45 cm)。在2018年7月份时，挑选长势一致的德果1号和湖桑32号各24盆。首先，将盆栽苗浇透水后进行连续的干旱处理，试验设置为对照处理(CK)(土壤含水量为85%～100%)、轻度干旱胁迫(土壤含水量为65%～75%)、中度干旱胁迫(土壤含水量为50%～65%)和重度干旱胁迫(土壤含水量为35%～40%)4个梯度处理，每个梯度处理设6个重复。土壤含水量采用烘干称重法测定，具体将盆栽苗浇透水后进行自然干旱，每天傍晚取土样(10～15 cm深)，待土壤含水量达到胁迫处理要求后，次日早晨8点，选取植株树冠同方位、同叶位叶片，以备各指标测定。

1.2 指标测定方法

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[19]。脯氨酸(Pro)含量测定采用磺基水杨酸法[20]。脱落酸(ABA)采用酶联免疫间接法[21]。SOD活性测定采用氮蓝四唑光化还原法[22]。POD活性测定采用愈创木酚法[23]。

水分饱和亏缺测定采用烘干称重[24]：首先称量叶片鲜重(Wf)，用蒸馏水浸泡24小时，取出用吸水纸吸去表面水分，立即称量饱和鲜重(wt)，最后置于105℃的烘箱中，烘4 h杀青，后调至80℃，烘至恒重后，称量干重(Wd)，相对含水量(RWC)=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)*100%；水分饱和亏缺(WSD)=(1-RWC)*100%。

电镜透射样本固定24 h后，用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，然后1%锇酸固定3 h，0.1 mol·L-1磷酸缓冲液冲洗20 min。经过乙醇系列脱水，丙酮过渡，EPON812环氧树脂包埋，Leica Ultracutr切片机切片，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，在透色电镜下观察，拍照[19]。

ROS(O2-)组织化学检测按照Wang等[25]的方法，含量测定按照Elstner和Heupel等方法[26]选取品种湖桑32和德果1号的正常处理和重度干旱处理样本，黑暗条件下浸泡于NBT中，在室温下保存一夜。取出后，将材料浸泡于无水乙醇中，然后在沸水中加热直到叶绿素褪去，再用甘油浸制固定材料并制成装片，显微拍照观察ROS(O2-)在细胞内部的变化规律。

1.3 数据统计分析

用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，采用二因素随机区组设计的方差分析法分析不同干旱处理间、桑树品种间、干旱处理间×桑树品种间的MDA、Pro、ABA、SOD、POD、WSD和ROS(O2-)含量的差异显著性。如果差异显著则分别用Duncan’s法进行多重比较，并用PSCC 2018软件作图。

2 结果与分析

由表1可以看出，除桑树品种×干旱处理间的桑树水分饱和亏缺(WSD)有显著差异外(P< 0.05)，品种间、干旱处理间、品种×干旱处理交互作用间桑树的MDA、Pro、ABA、SOD、POD和WSD 含量均存在极显著差异(P<0.01) ，需对上述各指标进行多重比较。

表1 桑树苗期生理指标方差分析表(F值)

2.1 干旱胁迫后各理化指标分析

随着干旱胁迫加剧，德果1号和湖桑32的MDA、ABA、Pro的含量呈上升趋势，各含量变化存在显著性差异(P< 0.05)。从正常处理到重度处理德果1号、湖桑32的MDA含量分别上升了103.81%、53.51%(图1B)。德果1号和湖桑32的Pro含量分别是正常处理时的12.86倍、14.15倍(图1C)。在重度胁迫时德果1号和湖桑32的ABA含量分别为229.56 μg·g-1·FW、250.66 μg·g-1·FW(图1A)。德果1号、湖桑32的水分饱和亏缺分别上升了192.24%、123.08%(图1D)。SOD、POD呈现出先升后降的变化趋势，且各含量变化存在显著性差异(P< 0.05)(图1E、F)。在中度胁迫时，SOD、POD酶活力达到最高水平，湖桑32和德果1号的SOD酶活力分别为754.5 U·g-1、710.0 U·g-1，而POD酶活力分别为213.35 U·g-1、137.08 U·g-1，该数据表明湖桑32的酶清除能力高于德果1号。

2.2 干旱胁迫下桑树叶片形态特征及ROS的分布规律变化

在对照水分条件下，湖桑32(图2a)和德果1号(图2g)长势良好，且ROS(O2-)的含量(图1G)及蓝色斑点聚合产物在湖桑32(图2c、e)和德果1号(图2i、k)的叶片上均有少量积累。重度干旱胁迫时，湖桑32出现轻度叶片萎蔫现象(图2b)，德果1号出现严重叶片萎蔫和大面积枯黄现象(图2h)。德果1号的ROS(O2-)含量是湖桑32 的1.32倍，且德果1号叶片上的蓝色斑点聚合产物面积增大、色度加深、主要分布于叶肉细胞及叶脉等部位，显著多于湖桑32(图2 j、l)。可能原因在于机体内防御系统崩溃，ROS清除机制功能异常，多种来源的ROS过度积累导致ROS爆发。德果1号的叶片ROS积累程度大于湖桑32，表明德果1号对干旱胁迫的防御机制差于湖桑32。

图1 不同干旱胁迫处理下生理指标的变化规律Fig. 1 The change trend on Physiological index with the aggravation of drought stress

图2 干旱胁迫引起的湖桑32(a、b)、德果1号(g、h)叶片形态学变化Fig. 2 Phenotypic symptoms of cultivars Husang 32 (a, b) and Deguo No.1 (g, h) in response to drought stress

2.3 干旱胁迫下叶片超微结构变化情况

正常水分条件下，湖桑32(图3a、b)和德果1号(图4a、b)叶肉细胞有明显的细胞核及叶绿体、线粒体等细胞器，各细胞的形状规则。叶肉细胞壁均匀，未出现断裂现象，细胞膜清晰可见。叶绿体较大、数目多，分布于细胞边缘，呈梭形，排列整齐且结构完整，同时类囊体片层垛叠整齐，膜系统结构清晰完整，未见有解体现象。叶绿体内部具有少量淀粉粒、嗜锇颗粒；重度干旱胁迫后，德果1号细胞结构(图4c、d)变化显著于湖桑32(图3c、d)，主要特征：出现明显的质壁分离和细胞壁断裂；细胞膜膨散，轮廓不清晰，内部结构混乱，细胞液泡收缩，核染色质凝聚，线粒体结构破坏；叶绿体囊体出现空泡化、片层结构混乱，淀粉粒变少等。

图3 湖桑32的超微结构分析Fig. 3 Scanning electron micrographs of Husang 32

图4 德果1号的超微结构分析Fig. 4 Scanning electron micrographs of Deguo No.1

3 讨 论

3.1 干旱胁迫引起的生理变化

所有生物都面临着突发和不利的环境条件(如：干旱、高温等)。植物与动物不同的是，植物是不能移动的，为适应各种不利环境，植物进化出了复杂的机制来感知外部信号，并对环境条件做出最佳反应[27]。首先，叶片的保水能力直接反映了植株的抗旱性[28]，叶片相对含水量越小，说明植物缺水越严重，适应干旱能力越弱；反之，则说明植物生理功能代谢旺盛，抗旱能力强[29]。本试验中，随着干旱胁迫加剧，德果1号的叶片含水量变化显著高于湖桑32，且德果1号叶片出现大面积的萎蔫和枯萎现象。而干旱胁迫引起桑树叶片水分饱和亏缺变化规律与干旱胁迫引起的叶片形态学结果相一致，这进一步证明德果1号的保水能力相对较差。叶片细胞为了维持在逆境下的渗透压，保证植物正常生长，Pro、ABA等物质的形成，能够有效提高细胞液浓度、降低细胞渗透势、调节气孔关闭以适应干旱胁迫[30-31]。植物在干旱胁迫条件下，Pro含量的增加，在一定程度上能够有效提高细胞液浓度、降低细胞渗透势，对维持叶片细胞渗透压和保证植物正常生长发挥着重要作用[30-31]。但渗透调节能力的大小因品种的不同而表现出差异性。研究表明，随着干旱胁迫加剧，Pro含量变化呈上升趋势与抗旱性呈正相关，其中湖桑32的Pro积累显著高于德果1号，说明湖桑32 具有较好的渗透调节能力，较高的Pro含量有利于缓解干旱胁迫对叶片造成的伤害[32]。ABA是一种植物内源激素，参与调控植物对逆境的响应，在干旱、寒害等胁迫环境下，具有促进植物水、肥吸收平衡和协调体内代谢的能力，可有效调控植物的营养生长与生殖生长，对提高农作物的产量和品质具有极其重要的作用[33]。另外，ABA能通过引起气孔关闭，降低蒸腾速率来改善干旱胁迫下植物的渗透调节作用，调节植株体内的水分平衡，保持质膜结构和功能，提高植物抗逆性[6-7]。因此，ABA含量高低可作为植物抗旱性强弱的指标之一。本研究结果表明，随着干旱胁迫加剧，ABA含量呈增加趋势，这标志着干旱胁迫应答机制的启动。且湖桑32的ABA积累显著高于德果1号，说明ABA对调节气孔开闭及调节植株体内的水分平衡，保持质膜结构和功能等方面发挥重要作用，从而使湖桑32表现出较强的抗旱性。

3.2 干旱胁迫引起的氧化应激反应变化差异

由于植物自身的渗透调节有一定的局限性，当干旱严重时，植物会表现出膨压不能维持、生长率下降和气孔阻力增加等现象[2]。因此，对植物细胞来说，如何维持活性氧产生与清除之间的平衡，增强抗氧化酶活性，从而避免对膜、光合器官等造成伤害，是其抵御逆境伤害的重要途径[34]，其中SOD是O2-和H2O2的主要清除剂，催化O2-分解成H2O2和O2，POD最终将H2O2转化为水和氧达到清除的效果[35-36]。但随着干旱胁迫加剧，这种动态平衡会被打破，造成植物体内的氧化胁迫[22, 37]。本研究表明：在正常处理下湖桑32(2c、e)和德果1号(2i、k)均有少量的ROS积累，推测适量ROS 的产生，可作为信号分子激活ROS酶清除系统发挥作用[18]。随着干旱胁迫加剧，湖桑32和德果1号的叶片均出现不同程度的ROS积累，而SOD(图1E)与POD(图1F)酶活力均呈先升后降的趋势，这一结果与韩刚[38]和沈萩荻[39]等人研究结果一致，即ROS浓度未超过“阈值”时，SOD和POD酶活性会表现出较好的协同作用；但ROS水平超出一定阈值，自由基产生与清除间的平衡失调，就会导致酶活性的降低[40]。时连辉[41]报道，桑树受到干旱胁迫时，细胞膜会受到伤害，透性增加，主要原因在于过量的ROS会引发膜脂过氧化加剧，导致膜结构破坏。而膜脂过氧化产物MDA含量高低，可以有效反映植物膜脂受氧化损伤的程度[42]。本研究表明，在重度干旱胁迫下，德果1号的ROS积累量和MDA含量(0.139 μmolg-1·FW)显著高于湖桑32，这与Yao等[13]、Ali等[43]、Zhu等[16]的研究一致，即ROS的产生与MDA成正相关。

3.3 干旱胁迫引起的细胞超微结构变化

叶片是植物感受干旱胁迫最敏感的器官，它的形态结构及生理变化可反映植株适应和抵御干旱的能力[44]。陈健辉等[45]对干旱胁迫下的3个大麦品种研究表明细胞结构的完整性与其抗旱性有关。本试验通过超微结构观察，正常供水条件下，湖桑32和德果1号的叶绿体都紧贴细胞壁分布，这种分布有利于CO2的吸收，进而促进光合作用[46]。干旱胁迫下，湖桑32和德果1号的叶绿体膨胀变形，淀粉粒变少、甚至消失，基质片层排列松散、囊泡化严重，产生嗜锇颗粒，叶肉细胞出现明显的质壁分离，叶绿体膜结构遭到破坏。湖桑32的叶细胞超微结构受损程度低于德果1号(图3)，说明湖桑32的抵抗干旱的能力强于德果1号，这与生理指标、形态学和ROS积累结果相一致。

四川攀西地区气候类型为干湿季节分明的季风气候，在6～10月为雨季，降雨量在600～1000 mm，占全年降雨量的90%以上；11月至翌年5月为干旱季节。由于攀西地区日照充足，且桑树具有很好的防风固土的作用，因此其成为攀西地区在二半山坡退耕还林的首选经济树种。经过长时间的育种选择和适应性推广，湖桑32和德果1号(果桑)已成为攀西地区的主要当家桑品种，对促进当地经济发展、脱贫致富和生态环境保护具有重要意义。而果桑(德果1号)以产果为主，采收季节在4～5月份之间，正处于攀西地区的干旱季节。为了保证果桑优良品质和产量，多采用漫灌浇水的措施，以缓解干旱造成的经济损失。但依然面临很多问题，如二半山坡灌溉困难，其次漫灌也造成大量的水资源浪费。因此，本研究通过抗旱性研究，探明德果1号和对照品种湖桑32的植物学特征、生理生化及细胞结构变化规律，为进一步阐明耐旱品种湖桑32和干旱敏感性品种德果1号的抗旱差异机理打下基础。在本试验基础上，课题组已完成德果1号和湖桑32在干旱胁迫下的转录组测序工作。下一步将从生理生化、细胞、分子学等角度出发，挖掘抗旱基因，为德果1号的品种改良提供理论依据。