聚己内酯/聚乙二醇大孔径纳米纤维膜的制备及其在组织工程支架中的应用

潘 璐， 程亭亭， 徐 岚,2

(1. 苏州大学 纺织与服装工程学院， 江苏 苏州 215123； 2. 现代丝绸国家工程实验室， 江苏 苏州 215123)

静电纺纳米纤维膜具有孔隙率高、比表面积大、生物相容性好等优点，在组织工程支架领域有着良好的应用前景。然而应用该技术制备的纳米纤维膜通常孔径小，易导致细胞生长受限，不利于营养物质传输和废弃物排泄，从而影响其在组织工程支架方面的应用[1]；因此，采用静电纺丝技术制备大孔径纳米纤维膜已成为该领域的研究热点。

目前，大孔径纳米纤维膜常用的制备方法有溶剂烧铸/颗粒浸出法[2]、改进接收装置法[3]、微纳米纤维沉积法[4]，物理修饰法[5]和调整纺丝参数法[6]。Nam等[2]使用同轴静电纺丝装置将NaCl颗粒附着在纳米纤维表层，然后用去离子水冲洗去除NaCl颗粒，最终得到多孔的纳米纤维支架；Blakeney等[7]将不锈钢探针嵌入接地的半球形圆盘中作为接收装置，成功制备了大孔径的静电纺纳米纤维支架；Shim等[8]将制备好的壳聚糖纳米纤维作为接收板，采用静电纺丝法制备了纳米-微米复合纤维膜；Gu等[9]利用超声处理静电纺丝技术制备了壳聚糖纳米纤维膜，改变了纳米纤维膜的孔径和厚度；Cheng等[10]设计开发了一种使用铜网作为接收装置，且其后放置有吹风装置的改进静电纺丝装置，并采用此装置成功制备了大孔径聚乙烯醇纳米纤维膜。

然而，Cheng等[10]在实验中采用的聚乙烯醇生物相容性较差，不利于其在组织工程中的应用。聚己内酯因其良好的生物降解性、药物透过性、生物相容性、原料易得，以及不会对人体产生毒副作用，可提高药物的稳定性等优点，被广泛应用于组织工程领域；但聚己内酯的结晶性很强，亲水性较差，属于疏水性材料，作为组织工程材料时不利于细胞的黏附。聚乙二醇的分子中存在大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有良好的亲水性，且其分子链两端的羟基有较好的反应性，可与很多化合物产生反应，用于修饰聚合物。故可将其与其他高分子聚合物共混，降低高分子材料的结晶度，增加材料的亲水性[11]。

综合以上分析，本文采用改进的静电纺丝装置[10]制备了PLC/PEG大孔径复合纳米纤维膜，研究了纺丝溶液溶质质量配比及其质量分数对复合纳米纤维膜形貌及其性能的影响，确定了最佳工艺参数，并探究了该大孔径纤维膜在组织工程中应用的可能性。

1 实验部分

1.1 实验原料

聚己内酯(PCL，相对分子质量为80 000)，上海源叶生物科技有限公司；聚乙二醇(PEG，相对分子质量为2 000)，国药集团化学试剂苏州有限公司；四氢呋喃(THF)，江苏强盛功能化学股份有限公司；无水乙醇(分析纯)，江苏强盛功能化学股份有限公司；高糖完全培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、青霉素&链霉素(双抗型)、胰蛋白酶(EDTA)、磷酸盐缓冲液(PBS)，苏州明德生物科技有限公司；二甲基亚砜(细胞培养级，DMSO)、戊二醛固定液(电镜专用，质量分数为2.5%)、噻唑兰(MTT)，苏州科创生物技术有限公司；丙酮，分析纯，苏州大学实验材料供应中心；人脐静脉内皮细胞(EC)，苏州大学医学院。

1.2 实验仪器

ISP01-A型恒流注射泵，保定兰格恒流泵有限公司；DW-P403-1ACCC型高压电源，天津东文高压电器有限公司；静电纺丝接收装置，实验室自制；S-4800型冷场发射扫描电镜，日本日立公司；INSTRON-3365型万能材料试验机，美国INSTRON公司；BPN-80CH(UV)型CO2培养箱，苏州凯茵生物科技有限公司；Synergy HT型全自动酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；3524型24孔板、3599型96孔板，美国康宁公司。

1.3 实验方法

1.3.1 纺丝溶液的配制

称取一定质量的PCL颗粒和PEG片状物加入到质量比为5∶1的四氢呋喃和无水乙醇混合溶液中，在室温下磁力搅拌至均一澄清配制纺丝液；按照该方法配制PCL和PEG纺丝液质量分数为25%，其中PCL和PEG的质量比分别为30∶70、50∶50、70∶30、80∶20、90∶10。确定PCL和PEG的最佳质量配比后，使用最佳质量配比，按上述方法继续配制质量分数分别为15%、20%、25%、30%的纺丝液，以确定最佳纺丝液质量分数。

1.3.2 大孔径纳米纤维膜的制备

改进静电纺丝装置如图1所示。

图1 改进的静电纺丝装置原理图Fig.1 Schematic of modified electrospinning device

该装置使用铜网作为接收装置，且其后放置有吹风装置。采用此装置制备PCL/PEG大孔径复合纳米纤维膜。根据文献[10]中的最佳纺丝参数，设定接收铜网网孔尺寸为4 mm×4 mm，风速为5 m/s，纺丝电压为12 kV，纺丝距离为18 cm，纺丝速度为1.0 mL/h。

1.3.3 细胞培养

将纳米纤维膜在紫外灯照射下杀菌4 h后，剪成1 cm×1 cm大小，放入乙醇溶液中浸泡1 h，然后用PBS冲洗3次后置于DMEM培养基中浸泡12 h，于室温下干燥备用。

取冻存人脐静脉内皮细胞(EC)复苏，置于CO2含量为5%和温度为37 ℃的培养箱中培养，观察细胞生长状态，待细胞增殖覆盖培养瓶的90%时开始传代。取生长状况良好的第3代，用EDTA酶消化细胞后，调整细胞浓度为1×105个/mL，按照每孔1 mL细胞溶液的要求将细胞分别接种于空白24孔细胞培养板、大孔径纳米纤维膜和对照样(传统静电纺纳米纤维膜)上，每组设置3个平行样，放入培养箱(5% CO2，37 ℃)中培养，每隔1～2 d更换1次培养基。

1.4 测试与表征

1.4.1 纤维膜表面形貌观察及纤维直径测试

在25 ℃条件下对样品进行表面喷金处理，采用扫描电镜观察纤维膜的表面形貌。使用Image J软件分析纤维的扫描电镜照片，每个样品中纤维直径均随机测量100次，计算平均值和直径分布。

1.4.2 纳米纤维膜的力学性能测试

将纤维膜制成长40 mm、宽10 mm的样品后，置于温度为20 ℃，相对湿度为65%的恒温恒湿室预调湿24 h以达到平衡回潮率。采用万能材料试验机对制备的纤维膜样品进行力学性能测试。试样的加持长度为20 mm，拉伸速度为20 mm/min，每组样品测试5次，取平均值。

1.4.3 纳米纤维膜的孔径测试

选择不同纺丝条件下制备的纳米纤维膜样品的相同倍数扫描电镜照片，使用Image J软件测量其孔径，每个样品各选10张，用Excel和OriginPro8.5计算纤维膜孔径的平均值及其分布。

1.4.4 纳米纤维膜的细胞相容性测试

采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法表征细胞的黏附情况和增殖能力。在24孔板中的纳米纤维膜上种植细胞后，分别在细胞培养了1、3、6、12 h和1、3、5、7 d时，向孔板每孔内加入200 μL的MTT溶液，置于CO2培养箱中孵化4 h后，转移至新的24孔板中并加入400 μL的DMSO摇晃10 min；再将混合后的溶液转移至96孔板中，每孔100 μL，同时设置DMSO的空白对照；最后将96孔板置于酶标仪中测定溶液吸光度值，选定波长为570 nm。根据测试的各样品的吸光度值分析细胞的黏附和增殖情况。

1.4.5 细胞生长的形貌观察

将细胞置于CO2含量为5%和温度为37 ℃的培养箱中培养，培养1、3、5、7 d后取出样品，用PBS冲洗3次后，用戊二醛溶液将纤维膜上的细胞固定，置于4 ℃的冰箱中静置一晚后取出，再用PBS冲洗3次；然后用质量分数为25%、50%、75%、90%和100%的乙醇梯度脱水各5 min；最后干燥样品，喷金90 s后于冷场发射扫描电镜下观察细胞的生长情况。

2 结果与讨论

2.1 溶质配比对纳米纤维膜性能的影响

2.1.1 形貌与直径分析

图2为不同PCL和PEG质量比的PCL/PEG纳米纤维膜的扫描电镜照片。

图2 不同PEG和PCL质量比纳米纤维膜扫描电镜照片(×10 000)Fig.2 SEM images of nanofiber membranes with different mass ratios of PEG and PCL(×10 000)

由图2可知：当PCL和PEG的质量比为30∶70、50∶50和70∶30时，纤维上均有串珠产生，且随着质量比的增加呈减少趋势；当二者质量比为80∶20和90∶10时，纤维上串珠消失，PCL/PEG纳米纤维的表面光滑且平直。这是因为PCL的相对分子质量比PEG大得多，因此，随着PCL占比的增大，PCL分子链形成的无规线团体积增大且缠结充分，导致大分子运动时内摩擦阻力增大，纺丝溶液的黏度增大[12]。当溶液黏度较小时，其可纺性较差[12]，纤维上易有串珠生成。随着溶液黏度增大，溶液可纺性变好，纤维的形貌也随之变好，当溶液黏度过大时，纺丝针头易堵塞，纺丝过程不稳定。

表1示出固定溶液质量分数情况下不同PEG和PCL质量比的PCL/PEG纳米纤维膜的直径统计结果。可知，当溶液质量分数不变时，PCL/PEG纳米纤维的平均直径随着PCL占比的增加而增大，且直径分布的均匀性也越来越差。这是由于PCL占比增多使得溶液黏度增大，从而导致纤维平均直径增大[12]。此外，当纺丝溶液黏度较大时，纺丝针头易发生堵塞，影响了纺丝过程的稳定性，从而导致纤维直径分布性越来越差。

表1 不同PEG和PCL质量比纳米纤维膜的直径统计结果Tab.1 Diameter statistics of nanofibers with different mass ratios of PEG and PCL

2.1.2 力学性能分析

表2示出不同PCL和PEG质量比的PCL/PEG纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率。可知，随着PCL占比增加，PCL/PEG纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率均呈增加趋势，断裂强度由0.62 MPa增加到3.71 MPa，断裂伸长率由25.13%增加至92.43%，表明PCL/PEG纳米纤维膜的力学性能随着PCL占比的增加而增强。这是因为随着PEG占比的增加，PEG分散相将以液滴形式存在于PCL连续相中，极大影响了纺丝过程的稳定性和纤维成形的连续性，破坏了纤维的成丝均一性，因此，随着单轴抗拉强度较大的PCL的占比增加[13]，以液滴形式存在的PEG分散相质量分数随之减少，纺丝溶液的黏度增加，可纺性变好，纺丝过程稳定，纤维形貌结构变好，无串珠生成，降低了弱环效应的影响，且纤维直径也随之增加，从而导致纤维膜的强度增加，且PCL纳米纤维膜对比PEG纳米纤维膜具有更好的柔韧性。

综上可知，当PCL和PEG的质量比为80∶20时，PCL/PEG纳米纤维膜的形貌较好，且纤维的平均直径较小，分布较均匀，力学性能也较好，故确定以80∶20质量比的PCL/PEG纳米纤维膜进行下一步实验分析。

表2 不同PCL和PEG质量比纳米纤维膜的力学性能Tab.2 Mechanical properties of nanofiber membranes with different mass ratios of PEG and PCL

2.2 纺丝溶液质量分数对纤维膜性能影响

2.2.1 对形貌结构和直径的影响

图3示出不同质量分数纺丝溶液制备的PCL/PEG纳米纤维膜的扫描电镜照片。可知：当纺丝溶液质量分数为15%和20%时，纤维上有微球产生，这是因为溶液质量分数较小时，其黏度也较低，可纺性差，溶剂快速挥发造成纺丝射流无法在外加电场的作用下被充分拉伸，故形成微球[14]；当质量分数为25%时，PCL/PEG纳米纤维膜的形貌光滑、平直，无微球出现；但当溶液质量分数增加到30%时，纳米纤维出现弯曲、表面不光滑，且有串珠出现，这可能是由于溶液质量分数过大，导致溶液黏度过大，可纺性差造成的。此外，当溶液质量分数为30%时，溶液黏度过大，流动性差，易凝结造成针头的阻塞，从而影响纺丝的持续进行。

图3 不同PCL/PEG质量分数纳米纤维的形貌(×10 000)Fig.3 Morphology of nanofibers with different PCL/PEG concentrations(×10 000)

表3为PCL和PEG质量比为80∶20时不同纺丝液质量分数下PCL/PEG纳米纤维的直径分布情况。

由表3可知，当PCL和PEG的质量配比不变时，纳米纤维的平均直径随着溶液质量分数的增加而增大，这主要是因为聚合物质量分数增加，使得纺丝溶液的黏度增加，从而导致纤维直径增加。

表3 不同PCL/PEG质量分数纳米纤维的直径统计结果Tab.3 Diameter statistics of nanofibers with different PCL/PEG mass fractions

2.2.2 对力学性能的影响

表4示出不同质量分数纺丝溶液制备的PCL/PEG纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率测试结果。可知，随着纺丝溶液质量分数的增加，PCL/PEG纳米纤维膜的断裂强度和断裂伸长率均呈增加的趋势。这是由于当溶液质量分数较低时，溶液黏度也较低，分子链相互缠结不充分，且纤维呈串珠状纤维结构，导致纤维膜力学性能较差；随着溶液质量分数的增加，溶液的黏度增加，大分子链之间缠结充分，可纺性变好，纤维形貌结构变好，从而使得纤维膜的断裂强度增加，断裂伸长率增加。

表4 不同PCL/PEG质量分数纳米纤维膜的力学性能Tab.4 Mechanical properties of nanofiber membranes with different PCL/PEG mass fractions

综上可知，当溶液质量分数为25%时，纳米纤维膜的形貌最好，且力学性能也较好，因此，选择溶液质量分数为25%进行下一步分析。

2.3 细胞在纤维膜上的黏附与增殖

图4示出在PCL和PEG的混纺质量比为80∶20，纺丝液质量分数为25%条件下制备的传统静电纺纳米纤维膜和改进静电纺纳米纤维膜的扫描电镜照片。表5示出2种方法制备的纳米纤维膜的平均孔径测试结果。可知，改进的静电纺丝方法制备的纳米纤维膜的孔面积较传统静电纺丝方法制备的纳米纤维膜的孔面积大。

图5示出人脐静脉内皮细胞在2种纤维膜及空白培养板上的黏附和增殖情况。从图5(a)可看出：在培养12 h内，细胞黏附在2种纤维膜和空白培养板上，且随着时间的延长，黏附细胞的数量略有增加；前6 h内细胞大都已经黏附在纳米纤维膜和空白培养板上，在后6 h吸光度值的变化不大，且改进静电纺制备的大孔径纳米纤维膜上细胞的黏附情况较传统静电纺纳米纤维膜的好。这是因为大孔径纳米纤维膜的孔径大，更利于细胞的黏附。

图4 传统和改进静电纺PCL/PEG纳米纤维膜的扫描电镜照片(×2 000)Fig.4 SEM images of traditional (a) and modified (b) electrospinning PCL/PEG membranes(×2 000)

表5 传统和改进静电纺PCL/PEG纳米纤维膜的孔面积统计结果Tab.5 Pore size statistics of traditional and modified electrospinning PCL/PEG membranes

由图5(b)可知：在细胞培养7 d的过程中，2种纤维膜上培养的细胞数量整体均呈增加趋势；培养1 d时，吸光度值没有显著性差异；培养3 d时细胞增殖逐渐加快，培养5 d时急剧增加，而至培养7 d时增殖又变得缓慢。此外，还可明显看出，培养1 d时2种纤维膜的吸光度值几乎相同，培养3 d时改进静电纺纳米纤维膜的吸光度值略高于传统的静电纺纳米纤维膜，而在培养5和7 d时，改进静电纺大孔径纳米纤维膜的吸光度值明显高于传统静电纺纳米纤维膜。这表明改进的静电纺大孔径纳米纤维膜上的细胞增殖较传统的静电纺纳米纤维膜快，且细胞数量多，说明大孔径纳米纤维膜更易于细胞的生长与增殖。

图6为人脐静脉内皮细胞在传统和改进静电纺纳米纤维膜上分别培养1、3、5、7 d的扫描电镜照片。可见：随着培养天数的增加，细胞数量增加，且培养3～5 d时，细胞增殖较快。此外，改进的静电纺大孔径纳米纤维膜上培养的细胞的增殖情况和生长情况较传统静电纺纳米纤维膜更好；培养7 d时，人脐静脉内皮细胞呈片状覆盖在传统静电纺纳米纤维膜上，而改进的静电纺大孔径纳米纤维膜的表面几乎完全被细胞覆盖。该结果进一步说明了PCL/PEG纳米纤维膜对细胞无毒，细胞可在其上获得良好的生长，并表明改进的静电纺丝装置制备的大孔径PCL/PEG纳米纤维膜更有利于细胞的生长和增殖。

图6 培养不同时间时人脐静脉内皮细胞在传统和改进的纳米纤维膜上的扫描电镜照片(×600)Fig.6 SEM images of EC cultured on traditional(a)and improved(b)nanofiber membranes at different times(×600)

3 结 论

1)PCL和PEG质量比及质量分数的不同均使得PCL/PEG纳米纤维膜具有不同的形貌和性能。当PCL和PEG的质量比为80∶20，纺丝溶液质量分数为25%时，纳米纤维膜的形貌较好，纤维直径较小且直径分布相对均匀，力学性能也较好。

2)改进的静电纺丝方法制备的PCL/PEG纳米纤维膜的孔面积较传统静电纺丝纳米纤维膜的大，其平均孔面积由9.00 μm2提高到了15.22 μm2。

3)人脐静脉内皮细胞在传统和改进的静电纺纳米纤维膜上的黏附和增殖情况表明PCL/PEG纳米纤维膜对细胞无毒，具有良好的细胞相容性，且改进静电纺丝装置制备的大孔径PCL/PEG纳米纤维膜更有利于细胞的生长和增殖，更适合应用于组织工程支架。