柱前衍生HPLC法测定复方首乌藤合剂多糖中5种单糖的含量

叶财发，蔡跃辉，曾棋平，曹毅祥，王庆芬

(联勤保障部队第九〇九医院/厦门大学附属东南医院制剂科，福建漳州 363000)

复方首乌藤合剂又名健脑合剂，为联勤保障部队第九O九医院神经内科常用特色方剂，临床应用30多年，由首乌藤、合欢皮、菟丝子、五味子、续断、蔓荆子、川芎、煅牡蛎8味中药组成，具有养心安神解郁、滋阴养肝、行血活气之功效，主要用于神经衰弱性失眠、眩晕及脑外伤引起的头痛、头晕等症[1]。复方首乌藤合剂组方复杂，成分多样，该制剂的现行质量标准主要控制其总黄酮、二苯乙烯苷的含量[2]，未包含多糖含量控制，然而相关研究[3-6]表明，多糖具有预防、改善、治疗失眠的作用，且滋阴养肝效果明显。为了更有效地控制该制剂的质量，本研究拟建立一种同时测定多糖中单糖含量的方法，现报道如下。

1 材 料

1.1 试药 甘露糖(批号140651-201504，含量99.4%)、盐酸氨基葡萄糖(批号140649-201606，含量100%)、半乳糖醛酸(批号111646-201702，含量95.1%)、葡萄糖(批号110833-201707，含量99.9%)、半乳糖(批号160226-201506，含量100%)、阿拉伯糖(批号111506-200202，含量100%)均购于中国食品药品检定研究院；三氯甲烷、正丁醇、氢氧化钠、盐酸、甲醇、乙醇、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和三氟乙酸为分析纯；乙腈为色谱纯；水为本院自制纯化水。

复方首乌藤合剂(规格40 ml/支，批号20190605、20190606、201906121、201906122、201906123、201906131、201906132、201906133、201906134、20190624，分别称为S1、S2、……、S10，本院自制)。

1.2 仪器 Agilent 1200 HPLC系统(包括DAD检测器，美国Agilent公司)；AUX220电子分析天平(精度0.1 mg，日本岛津公司)；KQY78-1磁力加热搅拌器、HH系列数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)； LD5-2A电动离心机(北京医用离心机厂)；101A-1E电热鼓风干燥箱(上海实验仪器有限公司)；KQ-500B超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海医用恒温设备厂)。

2 方法和结果

2.1 复方首乌藤合剂多糖的制备 精密吸取25 ml复方首乌藤合剂，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合液20 ml，在磁力搅拌器上搅拌30 min，以1.431×103×g离心20 min，回收上清液[7]。乙醇沉淀[8]：向上清液中加入3倍体积的95%乙醇，保持乙醇浓度在70%以上，静置过夜。以1.431×103×g离心15 min，收集沉淀物，于80 ℃真空干燥3 h，得到相应批号的复方首乌藤合剂多糖粉末，备用。

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 单糖对照品溶液的配制 分别精密称取甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖对照品适量，配制成浓度分别为3.1、1.276、1.01、1.0、1.18、1.04 mg/ml的单糖对照品溶液，备用。

2.2.2 混合对照品溶液的配制 分别精密吸取2.2.1项下的单糖对照品溶液各1 ml于同一10 ml容量瓶中，加水定容成混合对照品溶液，备用。

2.3 复方首乌藤合剂多糖的水解 精密称取2.1项下的多糖粉末150 mg，置于10 ml顶空瓶中，加3 ml水，再加三氟乙酸3 ml，封管，于110 ℃烘箱中水解1 h，取出，放冷，水浴蒸干，用甲醇1 ml溶解，蒸干，重复处理3次以除去残留的三氟乙酸，残渣加水溶解[8]，转移至5 ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得复方首乌藤合剂多糖水解液。

2.4 衍生化物溶液的制备 精密吸取单糖对照品溶液、混合对照品溶液、复方首乌藤合剂多糖水解液1 ml分别置于10 ml Eppendorf管中，分别加入1.0 ml PMP甲醇溶液(0.5 mol/L)和1.0 ml氢氧化钠溶液(0.3 mol/L)，混合均匀，于70 ℃水浴放置50 min，取出后冷却至室温，分别加入1.0 ml 0.3 mol/L 盐酸溶液中和，再加入2 ml三氯甲烷萃取，取上清液，重复处理 3 次[8]，除去未反应的PMP，用0.22 μm 滤膜过滤，即得。

2.5 色谱条件 色谱柱:依利特Krosmasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温35 ℃；流动相:乙腈-0.1 mol/L磷酸二氢钠缓冲液(pH=6.8)(18∶82)；流速1.0 ml/min；检测波长250 nm；进样量10 μl。

2.6 多糖特征峰的确认 通过对比单糖对照品溶液、混合对照品溶液和复方首乌藤合剂多糖水解液的衍生化物溶液的保留时间，对色谱图中主要色谱峰进行归属(见图1)，共识别出甘露糖、盐酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖。由于盐酸氨基葡萄糖峰面积小于6种单糖总峰面积的1%，基线对峰面积结果影响大，不适宜定量分析，故本研究拟以甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖为目标单糖并测定其含量。

2.7 方法学考察

2.7.1 线性关系 精密吸取2.4项下的衍生化物溶液，按照2.5项下色谱条件进样分析，进样体积为0.5、2、5、10、13、15、20、25、30 μl，测定5种单糖成分的峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)建立回归方程，见表1。

2.7.2 精密度实验 精密吸取2.4项下中混合衍生化物溶液，按照2.5项下色谱条件，连续进样5次，测得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、 阿拉伯糖峰面积的RSD分别为0.12%、 0.65%、 0.15%、0.20%和0.13%(n=5)，表明仪器的精密度良好。

图1 复方首乌藤合剂多糖的HPLC谱图Figure 1 HPLC chromatograms of polysaccharides in compound Polygoni Multiflori Caulis mixtureA:混合对照品溶液；B:复方首乌藤合剂多糖水解液；1:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮； 2：甘露糖；3：盐酸氨基葡萄糖；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；6：半乳糖；7：阿拉伯糖

表1 5种单糖类成分的线性回归方程及相关系数Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 monosaccharides

2.7.3 重复性实验 精密吸取复方首乌藤合剂(批号20190624)6份，按照2.1项下方法提取多糖组分，按2.3、2.4项下方法制备衍生物，再按2.5项下色谱条件进样，测得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为2.06%、3.71%、1.33%、1.87%和2.68%，说明该方法的重复性良好。

2.7.4 稳定性实验 精密吸取复方首乌藤合剂多糖水解液衍生化物溶液(批号20190624)，按照2.5项下色谱条件进样，分别于0、2、4、8、12、16、20 h进样，测得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别为1.26%、3.64%、0.65%、0.40%和0.87%(n=2)，表明供试品溶液在20 h内具有良好的稳定性。

2.7.5 加样回收率实验 精密吸取已知含量的复方首乌藤合剂多糖水解液(批号20190624)0.5 ml，精密加入0.5 ml一定浓度的对照品溶液，按2.3项下方法水解，按2.4项下方法进行衍生，再按2.5项下色谱条件进样分析，测定并计算各成分的加样回收率，结果见表2。甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的加样回收率分别为103.73%、99.41%、103.44%、103.19%和97.64%，RSD分别为2.25%、0.64%、1.75%、1.15%和2.98%(n=6)，表明该方法的准确度良好。

表2 各批次复方首乌藤合剂中单糖的含量测定结果Table 2 Content determination results of monosaccharides in compound Polygoni Multiflori Caulis mixture (ρB/mg·ml-1)

2.8 多糖中单糖的含量测定 取10批复方首乌藤合剂，精密吸取各批次的多糖水解液，按照2.4项下方法进行衍生，再按2.5项下色谱条件进样，并计算各批合剂中单糖成分的含量，结果见表2。甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量范围分别为3.35～5.21、0.17～0.37、1.59～2.32、0.46～0.78和0.15～0.27 mg/ml。不同批次间单糖的含量差异较大，RSD在13%～25%，但是不同批次中甘露糖含量均最高，葡萄糖次之。

3 讨 论

本研究比较了25 ℃、30 ℃、35 ℃三种不同柱温，发现各待测成分的分离度和理论塔板数均能达到要求。柱温为35 ℃时，整体出峰时间最快，峰形及分离度均较好，故选择35 ℃为检测柱温。另外，采用梯度洗脱方法时，色谱分离时间长，且改变温度或有机相比例均会影响各个特征峰的分离度或者峰形，故选择等度洗脱。

目前植物多糖提取主要集中在中药原药材[7,9]，较少应用于液体制剂。本研究主要参考刘晓晴[8]提取大柴胡汤多糖成分所用的水提醇沉法制备复方首乌藤合剂多糖，旨在去除该制剂中的蛋白质和植物单糖。前期研究发现，水提醇沉法提取后的多糖仍然含有少量的植物单糖，但是含量均较少，对实验结果影响较小，可忽略不计，因此水提醇沉法可以应用于提取复方首乌藤合剂中的多糖成分。

本研究结果表明，10批复方首乌藤合剂中的甘露糖含量均远高于其他单糖，约占总多糖含量的50%，葡萄糖占比约30%，可能是其主要活性物质。该制剂多糖中的单糖成分可能是其具有较强滋阴保肝功效的原因。查阅其他液体成品制剂，未见类似报道，可据此进行深入研究。

综上所述，本研究建立柱前衍生化法结合HPLC法同时测定复方首乌藤合剂多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量，可用于这5种单糖的定性及定量分析，为复方首乌藤合剂多糖质量控制提供参考。