阴道微生物菌群对宫颈癌前病变的影响

王 珊 ，齐红双 ，李 英

(1.南阳瑞康祥跃医学检验实验室； 2.南阳市南石医院检验科， 河南 南阳 473000)

宫颈癌在女性癌症发病率中居第四位，对女性健康造成严重影响[1]。近年来，宫颈上皮内瘤病变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)作为一组子宫颈癌前期病变的统称，得到了广泛关注，并成为临床研究热点。因为女性阴道微环境中宫颈上皮细胞处于暴露状态，其细胞病变和内部微生物变化存在一定关系[2-3]。相关报道[4]指出，阴道微生物群于高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)感染以及宫颈癌病变中，具有关键性作用。亦有研究[5-6]表明，阴道内部与宫颈病原微生物情况改变，可导致CIN，阴道微环境改变、性传播疾病、细菌性阴道病等紧密相关。为进一步了解阴道微生物菌群对女性宫颈癌前病变的影响，本研究以CIN患者与体检健康女性为研究对象进行了以下研究，以期为宫颈癌前病变诊治提供依据，报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年3月—2019年4月南阳市南石医院诊治CIN患者60例。纳入标准：①年龄20～45岁。②月经正常。③近7 d内无性行为。④近期未接受抗生素治疗或者阴道冲洗用药。排除标准：①阴道出血、阴道溃疡或者阴道有异常分泌物者。②合并泌尿生殖炎症。③处于妊娠期、哺乳期及经期者。④存在宫颈病变史。⑤合并严重内科疾病。按照病变程度分为I级组(n=25)、Ⅱ级组(n=20)、Ⅲ级组(n=15)，取同期60例体检健康女性纳入对照组(均有健康体检报告，无相关疾病)。本研究经院伦理委员会批准，所有对象均对本研究知情并签署知情同意书。Ⅰ级组年龄26～43(35.07±3.82)岁，体质量指数(body mass index，BMI)(23.02±2.46)kg·m-2；Ⅱ级组年龄25～42(34.98±3.80)岁，BMI(22.95±2.43)kg·m-2；Ⅲ级组年龄25～41(35.02±3.79)岁，BMI(22.86±2.41)kg·m-2；对照组年龄27～45(35.01±3.83)岁，BMI(23.05±2.48)kg·m-2。4组年龄(F=0.00，P=1.000)、BMI(F=0.03，P=0.994)比较,差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 操作方法 通过illumina Miseq测序平台完成阴道微生物检测过程。①样本采集：将医用无菌棉拭子伸入阴道后穹窿部位，并且轻转10～15 s，确保其充分吸收分泌物后取出放入干燥无菌试管内部，并当即存储于-80 ℃条件下，以备后续细菌基因组DNA提取操作。②总DNA提取：采取细菌基因组DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司，型号：QIAamp DNA Mini Kit)，严格依据说明书操作进行：首先采用lysozyme裂解，然后离心处理，重悬之后，加入蛋白酶K 20 μL溶解，从56 ℃水浴箱里面取出EP管，进行短暂离心处理，往管内加入200 μL无水乙醇，将其涡旋混匀15 s，转入离心柱中继续离心1 min，把柱子置于新套管内，依次加入500 μL AW1以及500 μL AW2进行离心；加入100 μL AE溶液之后室温孵育1～5 min，且离心1 min，再重复加入100 μL AE溶液，离心1 min；获得DNA后，存储于-20 ℃条件下。③16S rRNA V3、V4区PCR扩增以及Illumina Miseq测序：引物对选择338F与806R，模板为提取所得稀释后基因组DNA，通过PCR扩增仪(美国ABI公司，型号：ABI GeneAMP 9700)，于处于稀释状态基因组DNA基础上，进行16S rRNA V3、V4 区相应基因片段扩增，同时对其双末端予以测序(2×300bp)操作。引物序列见表1。PCR扩增体系如下：5×FastPfu 缓冲液与浓度2.5 mmol·L-1dNTPS分别为4、2 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，上下游引物均为0.8 μL，模板以及灭菌去离子水分别为0.5、11.5 μL。PCR具体扩增条件如下：初始变性采用95 ℃进行3 min预变性，然后再以95 ℃进行30 s变性，接着55 ℃退火30 s，保持72 ℃延伸45 s， 27个循环后，保持72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。采取质量分数2%琼脂糖凝胶对相应PCR产物予以电泳检测，按照产物浓度将其等量混合，然后在Illumina MiSep测序平台完成测序过程。通过测序检测出微生物菌门数与菌属数。

表1 引物序列

以MiSep Reporter v.1.8.1软件(illumina，San-Diego，CA，USA)之中默认参数拆分原始测序数据，同时去除接头序列以及低质量序列，然后利用质量控制以及序列拼接方式获取V3、V4区相应组装序列。通过Uparse软件过滤组装序列，有效删除短序列以及嵌合体序列，采用97%的序列一致性把其中有效数据聚集成操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。通过Mothur分析流程，把所获得OTU比对至SILVA数据库予以物种注释，注意阈值为0.8。采取Mothur软件之中pca命令分析样品菌类中主成分，呈现样品间相似度，采取LefSe分析各个组间群落结构与其中菌群差异性。

1.2.2 观察指标 比较Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级组与对照组阴道微生物菌门组成(包括厚壁菌门数、放线菌门数及其他菌门数)与菌群组成(包括乳酸杆菌属数、奇异菌属数、加德纳菌属数以及其他菌属数)。

2 结果

2.1 4组受试者阴道微生物菌门组成比较 阴道厚壁菌门数：Ⅰ级组低于对照组、Ⅱ级组与Ⅲ级组;放线菌门数：Ⅰ级组高于对照组、Ⅱ级组与Ⅲ级组；其他菌门数：对照组<Ⅰ级组<Ⅱ级组<Ⅲ级组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.2 4组受试者阴道微生物菌群组成比较 Ⅰ级组阴道乳酸杆菌属数显著低于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)，其他3组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；I级组阴道加德纳菌属数与奇异菌属数高于其他3组(P<0.05)；其他菌属数：对照组>Ⅰ级组>Ⅱ级组/Ⅲ级组(P<0.05)。见表3。

表2 4组受试者阴道微生物菌门组成比较

表3 4组受试者阴道微生物菌群组成比较

3 讨论

女性阴道内部由很多细菌定植构成动态微生态体系，临床认为其中微生物菌群为保持生态平衡的主要部分[7-8]。健康女性阴道内部菌群主要包括厚壁菌门，以乳酸杆菌属数量占绝对优势，同时亦有低丰度菌属(如加德纳菌属、奇异菌属等)[9-10]。本研究中，I级组阴道厚壁菌门数显著低于其他组，放线菌门数显著高于其他3组，且其他菌门数：对照组<Ⅰ级组<Ⅱ级组<Ⅲ级组，表明CIN Ⅰ级病变患者阴道厚壁菌门数呈现降低趋势，而放线菌门数呈现升高改变，CIN患者有其他菌门数增多表现，尤其以Ⅱ级与Ⅲ级病变患者更显著，阴道厚壁菌门数的减少与放线菌门数的增加可能增加HR-HPV感染风险，但是均不参与CIN Ⅱ级与Ⅲ级病变，其他菌门数的增加可能提高CIN病变率，且增加越多，CIN病变程度越严重。乳酸杆菌不但可以维持阴道微生态动态平衡，其分泌的抗微生物因子亦可抑制致病微生物生长，提高阴道局部抗感染及抗肿瘤功能，还可以阻止病原菌黏附于女性阴道黏膜上皮细胞表面，起到防止病原菌侵袭作用[11-12]。本研究发现，I级组阴道乳酸杆菌属数显著低于其他组，表明乳酸杆菌属数减少可能导致宫颈上皮组织HR-HPV感染率增加。但是对照组与Ⅱ级组、Ⅲ级组比较无显著差异，表明乳酸杆菌属对女性CIN进展或消退造成的影响较小。相关研究[13-14]指出，加德纳菌属可以激活机体炎症反应，提高细胞溶解素水平，其增多能促进阴道内部上皮细胞死亡，使乳酸杆菌属数减少，提高阴道内部感染HR-HPV风险。本研究结果显示，Ⅰ级组阴道加德纳菌属数与奇异菌属数显著高于其他Ⅱ、Ⅲ组，表明加德纳菌属与奇异菌属数在CIN I级患者中大量增加，与上述研究观点相符，加德纳菌属数、奇异菌属数参与CIN I级病变，但是对Ⅱ、Ⅲ级病变影响较小。对于奇异菌属，可能因为其能够对阴道上皮细胞本身免疫功能造成刺激，还可以诱发严重免疫反应及炎症反应，从而参与CIN I级病变[15]。本研究中，其他菌属数：对照组>Ⅰ级组>Ⅱ/Ⅲ级组，表明其他菌属数的减少可能增加CIN病变风险，且减少程度越高，CIN病变程度越严重。

综上，女性阴道微生物构成里面，厚壁菌门数、放线菌门数、乳酸杆菌属数、加德纳菌属数及奇异菌属数变化可对微生态平衡产生影响，可能参与宫颈癌病变形成。