酸性手性药物在直链淀粉手性固定相上的拆分

祝金艳 徐 文 艾 萍 袁黎明

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

手性药物是一类非常重要的化合物，目前临床药物有3 500余种，其中约一半为合成药，而合成药物中约一半是外消旋体[1]。外消旋体药物与生物大分子对映体之间具有立体选择性，导致手性药物在生物体内显现出不同药理活性。研究发现某些外消旋体药物中，一种立体异构体具有药效，而另一种则无效或有毒副作用。因此研究手性药物的拆分方法，对手性药物的药理学、毒理学的研究和开发具有重要意义[2-3]。

高效液相色谱手性固定相法是分离手性化合物对映体最常用的分析方法之一。在众多的手性固定相中，应用最广的是由Y. Okmoto课题组开发的多糖衍生物类手性固定相，该课题组经过大量的研究，开发出了以纤维素和直链淀粉为手性分离材料的商品柱。张美[4]等人用4根商品手性色谱柱OD、AD、 IA、Whelk，根据说明书中推荐的最佳流动相正己烷-异丙醇(90∶10, V/V)、正己烷-乙醇(90∶10，V/V)拆分了扁桃酸、DNB-亮氨酸、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬在内的38个手性化合物。邵红[5]用键合纤维素衍生物手性固定相在流动相为正己烷-异丙醇(95∶5，V/V)拆分酮洛芬。

目前大部分的文献报导是用直链淀粉柱在正相模式下拆分手性药物，与其相比，反相模式的流动相具有低成本、污染小、应用范围广等优势，所以反相模式拆分是液相手性固定相法拆分手性化合物的发展趋势，具有较好的应用前景。本文将自合成的直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)分别涂覆到5种表面不同衍生化的硅胶上，在反相流动相(甲醇∶水的3种不同比例)下拆分5种酸性手性药物，并与正相流动相(正己烷∶异丙醇=9∶1)下的情况做了对比。目前还未见系统研究直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)分别涂覆到不同衍生化硅胶上的比较研究。本文研究的5个药物对映体的结构如图1所示。

图1 扁桃酸(a)、DNB-亮氨酸(b)、布洛芬(c)、酮洛芬(d)、氟比洛芬(e) 化学结构

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)，EYELA磁力搅拌低温恒温水槽(PSL-1810，上海爱朗仪器有限责任公司)，RE 5298A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，DHG-9035A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AL204梅特勒-托利多电子天秤(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，PHS-25雷磁pH计(上海精密科学仪器有限公司)，Model 1666 Slurry Packer高效液相色谱装柱机(美国All-tech公司)，XL30ESEM-TMP型扫描电子显微镜(荷兰飞利浦公司)，高纯水机(英国ELGA Lab Water)，高效液相色谱仪(配有Elite P 1201高压恒流泵、Elite P 1201紫外检测器、EC 2006型色谱工作站，大连依利特分析仪器有限公司)。

大孔硅胶(粒径7 μm，孔径100 nm，日本Daisoge公司)；直链淀粉、3-氨丙基三乙氧基硅烷、3,5-二甲基苯基氨基异氰酸酯(阿达玛斯试剂有限公司)；十八烷基三氯硅烷(95%，阿达玛斯试剂有限公司)；正辛基二甲基氯硅烷(阿拉丁试剂有限公司)；正丁基二甲基氯硅烷(98%,阿尔法试剂有限公司)；所用溶剂(天津市风船化学试剂科技有限公司)(分析纯)；手性化合物(西格玛和阿拉丁试剂有限公司)。

1.2 手性固定相的合成

直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(ADMPC)的合成[6-7]：将1 g直链淀粉加入到圆底烧瓶中，在100 ℃下真空干燥6 h，冷却至室温。N2保护下，加40 mL无水吡啶搅拌1 h，让直链淀粉溶胀，再加入3.9 mL 3,5-二甲基苯基氨基异氰酸酯，在85 ℃ 下搅拌回流24 h，冷却至室温，将产物倒入大量的甲醇中，白色絮状物析出，搅拌过夜，减压抽滤，用甲醇洗涤，65 ℃下真空干燥24 h，得到白色固体。

C4大孔硅胶的合成：N2保护下，称取10 g活化大孔硅胶于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL无水甲苯，4 mL正丁基二甲基氯硅烷和10 mL吡啶，110 ℃ 搅拌回流6 h。冷却后加入1 mL三甲基氯硅烷，110 ℃搅拌回流4 h。反应完成后，冷却减压抽滤，依次用甲苯、甲醇、二氯甲烷多次洗涤，然后在50 ℃ 下真空干燥5 h，得到C4反相大孔硅胶。

C8反相大孔硅胶的合成：步骤同C4大孔硅胶。

C18反相大孔硅胶的合成：N2保护下，依次将8 g活化后的硅胶，100 mL无水甲苯，10 mL十八烷基三氯硅烷加入到圆底烧瓶中，110 ℃搅拌回流24 h。冷却后减压抽滤，并用无水甲苯多次洗涤。将抽滤后的硅胶迅速加入到圆底烧瓶中，抽真空，充N2，在N2保护下加入100 mL无水甲苯，1 mL三甲基氯硅烷，在110 ℃ 搅拌回流6 h，冷却后减压抽滤，依次用甲苯、甲醇、二氯甲烷多次洗涤，在50 ℃下真空干燥5 h，得到C18反相大孔硅胶。

氨丙基大孔硅胶的合成：N2保护下，将10 g活化硅胶加入到150 mL圆底烧瓶， 150 ℃条件下干燥6 h，冷却至室温。在N2保护下，先加100 mL无水甲苯搅拌10分钟，再加1.2 mL无水吡啶搅拌10 min，最后加1.6 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，在100 ℃下搅拌回流24 h，反应结束后，冷却减压抽滤，洗涤多次，真空干燥，得到氨丙基大孔硅胶。

1.3 直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相的制备

取5个25 mL的烧瓶中，分别加入0.3 g ADMPC和8 mL吡啶将其溶解，采用旋转蒸发法，将上述溶液分别涂覆于1.7 g的5种硅胶表面，即得到相应的固定相：ADMPC-C4大孔硅胶(CSP-A)、ADMPC-C8大孔硅胶(CSP-B)、ADMPC-C18大孔硅胶(CSP-C)、ADMPC-NH2大孔硅胶(CSP-D)、ADMPC-大孔硅胶(CSP-E)。

1.4 液相色谱柱的制备

将上述制备的 5种手性固定相过250目筛，采用高压匀浆法装柱，分别将 1.2 g固定相加入适量的(V正己烷∶V异丙醇=9∶1)溶液做顶替液，在40～50 MPa压力下装柱，制备了柱维为2.0×250 mm的液相色谱柱。

1.5 色谱的拆分条件

以V正己烷∶V异丙醇=9∶1、甲醇、V甲醇∶V水=9∶1、V甲醇∶V水=3∶1为流动相，流动相中均添加0.2%的三氟乙酸，并经0.45 mm的滤膜过滤，流速为0.1 mL/min，检测波长为254 nm。扁桃酸、DNB-亮氨酸、布洛芬、酮洛芬、氟比洛芬用流动相进行溶解。

2 结果与讨论

2.1 手性固定相的核磁表征

在常温下以氘代吡啶为溶剂，测ADMPC的核磁氢谱。如图2，化学位移7.20 ppm、7.55 ppm、8.69 ppm是吡啶的氢峰；1.50～2.10 ppm、2.10～2.50 ppm分别是直链淀粉结构2-和3-位引入3,5-二甲基苯基氨基异氰酸酯上-CH3的质子峰和6-位引入3,5-二甲基苯基氨基异氰酸酯上-CH3的质子峰；3.00～6.00 ppm为直链淀粉结构上的质子峰；6.00～8.00 ppm为苯环上的质子峰；9.00～11.50 ppm为氨基的质子峰。由核磁氢谱可以确认直链淀粉上2-、3-和6-位的羟基被3,5-二甲基苯基氨基异氰酸酯反应，表明成功合成了ADMPC。

图2 直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的核磁氢谱图

2.2 手性固定相的扫描电镜表征

高分子溶液具有一定的黏度，将其涂覆到硅胶表面时，需尽量避免硅胶颗粒之间的粘连，商品化的多糖手性柱能做到固定相颗粒的高度分散，该技术是多糖手性柱厂家的核心技术之一。图3中(A)、(C)、(E)、(G)、(I)是硅胶表面未涂覆ADMPC的扫描电镜图，硅胶表面相对光滑。图(B)、(D)、(F)、(H)、(J)是ADMPC涂覆后的5种不同硅胶，可见硅胶颗粒表面有附着物。另外由于大孔硅胶孔径大，部分涂覆溶液可能进入到大孔的内部。

图3 10种硅胶的扫描电镜图. (A) C4大孔硅胶；(B) CSP-A；(C) C8大孔硅胶；(D) CSP-B；(E) C18大孔硅胶；(F) CSP-C；(G) NH2大孔硅胶；(H) CSP-D；(I) 大孔硅胶；(J) CSP-E

2.3 5种酸性手性化合物在不同流动相下的拆分

表1 手性药物在5 种色谱柱CSP-A至CSP-E上的拆分数据

将ADMPC分别涂覆在4种不同衍生化大孔硅胶及纯大孔硅胶上制得CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E， 以V正己烷∶V异丙醇=9∶1为流动相，表1为5种色谱柱对5种酸性手性药物的拆分性能。实验结果表明，扁桃酸、DNB-亮氨酸、酮洛芬、氟比洛芬四种酸性手性药物在这5根色谱柱均有一定的拆分效果，其中DNB-亮氨酸拆分效果最佳，均能达到基线分离。

将上述的5根色谱柱分别在流动相为甲醇、V甲醇∶V水=9∶1、V甲醇∶V水=3∶1的条件下的拆分5种酸性手性药物。实验结果见表2，结果表明扁桃酸和酮洛芬在这三种流动相中无拆分，DNB-亮氨酸和氟比洛芬在这三种流动相中均有不同程度的拆分，其中氟比洛芬在流动相为V甲醇∶V水=3∶1的条件下拆分效果优于流动相V正己烷∶V异丙醇=9∶1。当流动相为V正己烷∶V异丙醇=9∶1 时，布洛芬在CSP-A～CSP-E上均无拆分效果；当流动相为V甲醇∶V水=3∶1时，布洛芬在CSP-A～CSP-D上得到了一定的拆分。

表2 手性药物在5种色谱柱CSP-A至CSP-E上的拆分数据

2.4 5种酸性手性化合物的最佳拆分条件

对5种酸性手性化合物的拆分条件进行优化，得到5种酸性手性化合物的分离最佳谱图。图4(a)是扁桃酸在CSP-D，流动相为V正己烷∶V异丙醇=9∶1上的色谱图；图4(b)是DNB-亮氨酸在CSP-C，流动相为V正己烷∶V异丙醇=9∶1上的色谱图；图4(c)是布洛芬在CSP-B，流动相为V甲醇∶V水=3∶1上的色谱图；图4(d)是酮洛芬在CSP-C，流动相为V正己烷∶V异丙醇=9∶1 上的色谱图；图4(e)是氟比洛芬在CSP-A，流动相为V甲醇∶V水=3∶1上的色谱图。图4的其他色谱条件如下：流速：0.1 mL/min；柱温：25 ℃；紫外检测波长：254 nm。

(a)

3 结论

实验结果表明，5种酸性手性药物在5种手性柱上都有不同程度的拆分，不同样品的最佳拆分条件有一定差异，在反相大孔硅胶上涂覆ADMPC拆分5种酸性手性药物的整体效果优于氨基化大孔硅胶和纯大孔硅胶；流动相的选择对样品的拆分也有一定的影响，当样品在大极性流动相下能够得到拆分时，流动相含水量较高时拆分性能较好；这些不同的手性柱在两种模式的流动相下拆分酸性手性药物有一定的互补性。本实验为后续相关药物的对映体分离研究提供了参考。