长链非编码RNA在心血管疾病中的作用及机制*

李 鼎， 王大新， 梁景岩

1中南大学湘雅二医院心血管内科，长沙 4100112江苏省扬州大学临床医学院(苏北人民医院)心血管内科，扬州2250013江苏省扬州大学医学院，扬州225009

1 LncRNA概述

1.1 LncRNA的来源与结构

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，具有5′端甲基化帽和3′端多聚A尾，结构与mRNA相似的、核苷酸数大于200的功能性RNA分子。与mRNA相比，LncRNA缺乏完整的开放阅读框。最近，在人类基因组中发现了19175个潜在的功能性LncRNA[1]。根据LncRNA在基因组位置、与邻近编码蛋白质的关系及对基因序列的影响，它们通常被分为顺式、反式、双向、基因内及基因间等5种类型。由于LncRNA具有较长的序列及复杂的三维结构，结构域复杂，因此有着能够和包括DNA、RNA和蛋白质在内的各种大分子相互作用的多种位点，作用范围涉及基因表观遗传水平、转录水平和转录后水平的调控，也可作为竞争RNA发挥“海绵”作用[2]。对心血管疾病的发生和发展有着独特的“隐形”调节功能。总体而言，LncRNA一般是通过LncRNA/circRNA-miRNA-mRNA轴参与这一过程。

LncRNA多数定位在细胞核[3]，这是因为其剪接效率低、多聚腺苷化以及易被染色质上的外泌体降解。同时LncRNA所具有的灵长类特异性的短散布核元件(SINE)与核基质蛋白HNRNPK结合可促进LncRNA核保留。另外一些特殊结构的LncRNA含有与核蛋白相关的特定顺式元件亦促进LncRNA在细胞核中累积。当LncRNA定位于细胞核之后，LncRNA能对核组织及其功能起到重要调节作用。

1.2 LncRNA的生物功能

LncRNA对基因表达的调节可有以下几种方式：①信号分子，LncRNA在特定的时间表达，在特定的空间发挥作用；②诱饵分子，LncRNA引诱转录因子和其他蛋白质与染色质隔离，利用与mRNA互补的序列结合mRNA从而减少基因翻译，进一步抑制转录表达；③引导分子，LncRNA引导转录因子与特定的基因启动子区域结合，或者使用与启动子DNA互补的序列促进靶基因激活；④骨架分子，LncRNA将2个或更多蛋白质结合组成核糖核蛋白复合体参与修饰染色质；⑤增强分子，LncRNA诱导染色体将增强子和启动子区域结合在一起促进下游翻译[4-6]。

2 LncRNA与血管内皮疾病

目前炎症学说是广为认可的与动脉粥样硬化病理演化相关的学说，在炎症因子刺激下，血管内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和心肌成纤维细胞共同参与一系列病理生理学改变如增殖、迁移、凋亡、纤维化、自噬和坏死。研究表明，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型从收缩状态到合成状态的转换促成了包括动脉粥样硬化、粥样斑块稳定和血管内膜增生在内的多样化血管病变。

一些在人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery vascular smooth muscle cells，HCASMCs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中富含的LncRNA能够促进内皮细胞和平滑肌细胞富集、迁移、分化，LncRNA可通过调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFA)、缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)等因子而调节血管生成的各个过程；血小板衍生生长因子家族成员之一的VEGFA，能增强血管通透性，诱导新生血管生成，扩张血管床。在低氧条件下，HIF-1可通过与其他促血管生成因子如VEGFA或血管生成素等相互作用，参与生理性或病理性调节血管生成途径。LncRNA也可作为内源性海绵调节基因来调节下游与血管生成有关的miRNA功能而间接调节血管生成。因此，LncRNA是抗血管生成潜在的治疗靶点，其对于心血管类疾病炎症通路的影响不可忽视。

2.1 LncRNA调节与动脉粥样硬化密切相关的平滑肌细胞及内皮细胞功能

来源于内皮细胞的外泌体的基因间LncRNA-RNCR3具有动脉粥样硬化保护作用，也被称为LINC00599，在小鼠和人主动脉粥样硬化病变中的表达显著上调[7]。敲除RNCR3后，动脉粥样硬化进程加快并且高胆固醇血症加重，炎症因子释放增加，血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)和血管平滑肌细胞减少增殖和迁移，细胞凋亡加速。在体外实验中，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL)在内皮细胞和血管平滑肌细胞中沉积后，LncRNA-RNCR3水平显著升高。LncRNA-RNCR3作为竞争性内源RNA(ceRNA)，与Kruppel-like factor 2和miR-185-5p形成反馈回路，共同调节细胞功能。诱导RNCR3上调是防治动脉粥样硬化相关血管功能障碍的有效干预策略。

通过对RNA序列数据库分析，Ballantyne等[8]发现了位于8号染色体上，距离蛋白编码基因HAS2 750 kb的LncRNA-SMILR，HAS2可编码合成透明质酸(HA)酶，而透明质酸是动脉粥样硬化病变及血管再狭窄时组成细胞外基质的关键成分。研究发现具有血管平滑肌细胞特异性过表达HA的转基因小鼠对动脉粥样硬化的易感性增加，并在袖带损伤后形成了增强的新内膜。与未受刺激的细胞相比，受到白细胞介素1α和血小板衍生生长因子刺激的血管平滑肌细胞显著上调表达LncRNA SMILR。对不稳定动脉粥样硬化斑块性病变分析发现，LncRNA SMILR水平与炎症标志物C反应蛋白水平相关，都呈现升高趋势，并且LncRNA-SMILR能够特异性靶向HAS2而不影响HAS1或HAS3。因此下调SMILR水平可以特异性抑制HAS2表达调控VSMC的增殖[9]，对血管动脉粥样硬化有保护作用。

2.2 LncRNA调节与动脉粥样硬化有关的炎症反应

当血管内皮细胞处于炎症环境下时，动脉粥样硬化进程加快。LncRNA Let-7e抑制靶基因(IκBβ)的表达来促进NF-κB的活化及向细胞核转运，增加了炎症因子和粘附分子的表达，促进血管内皮细胞的炎症反应和动脉粥样硬化的发生发展[10]。而LncRNA-MKI67IP-3充当Let-7e的竞争性内源RNA(ceRNA)，抑制其促炎作用，减轻炎症反应。但Let-7e也能以正反馈的方式下调LncRNA-MKI67IP-3进一步加重炎症反应。进一步揭示针对LncRNA-MKI67IP-3的干预措施可以限制动脉粥样硬化的进展和不利的血管重塑。

LncRNA NEXN-AS1(nexilin F-actin，结合蛋白反义RNA 1)可调节肌动蛋白结合蛋白(NEXN)的表达[11]，对动脉粥样硬化有保护作用。通过对表达芯片的分析发现，在人动脉粥样硬化斑块中NEXN-AS1和NEXN的表达均降低。NEXN-AS1表达的增强抑制了TLR4寡聚化和NF-κB活性，下调内皮细胞粘附分子和炎性细胞因子的表达，并抑制单核细胞粘附于内皮细胞，从而改善动脉粥样硬化斑块的形成。

研究发现，与ApoE-/-/MALAT1+/+对照小鼠相比，使用高脂饮食喂养的ApoE-/-/MALAT1-/-小鼠动脉粥样斑块体积和炎性CD45+细胞浸润增加[12]。在人类动脉粥样硬化中也观察到了类似情况，并与心血管不良预后事件相关。MALAT1(肺腺癌转移相关转录本1)以“海绵”的形式吸附干扰miR-503来实现抗炎并抑制动脉粥样硬化。当MALAT1缺乏将导致髓样细胞与血管壁的粘附增强和细胞因子产生增加，动脉粥样硬化情况进一步恶化。在糖尿病人群中已发现miR-503损害缺血后修复性血管生成。

目前研究表明LncRNA除了参与动脉粥样硬化病理性进程，调控平滑肌细胞、内皮细胞功能及血管周围炎症反应以外，也可以促进新生血管生成。

在ApoE-/-小鼠及t-BHP处理后的HUVEC的血清样本中，LncRNA NEAT1表达增加，miR-181d-5p表达减少[13]，进一步研究发现LncRNA NEAT1通过靶向作用于miR-181d-5p/CDKN3轴降低了HUVEC凋亡及Caspase-3活性，产生促血管生成的效果。

LncRNA HOTAIR通过在转录水平直接调节VEGFA表达或者间接通过葡萄糖调节蛋白(GRP)78-Ang2-VEGFA轴上调合成VEGFA，进一步促进血管生成[14]。

目前随着冠脉介入手术的不断应用和发展，在血管重塑过程中，当血管平滑肌细胞表型从收缩状态转换到增殖状态时，去分化的血管平滑肌细胞在内膜中积聚，最终导致血管动脉硬化再狭窄。而稳定的内皮功能对于维持血管生理功能，保障冠脉支架植入的长期通畅至关重要。内皮细胞能调节血管对剪应力变化的反应，支架植入后管腔内皮细胞单层的快速再生是防止支架内再狭窄和血栓形成的关键[15]。研究发现，LncRNA在血管成形术后再狭窄中扮演的角色同样不可忽视。例如与正常人相比，冠心病患者的冠状动脉组织中LncRNA-p21下降，这种下降在一定意义上加剧了血管急性损伤后的再狭窄[16]。研究人员使用一种蛋白质-RNA结合的预测方式catRAPID发现lncRNA-p21能与MDM2(mouse double minute 2)结合，减少MDM2与p300的结合，从而促进乙酰化转移酶p300与p53结合，p53乙酰化后活性增强，加快凋亡的进程。反之，敲除lncRNA-p21会抑制p53活性，并改变MDM2/p53和p300/p53复合体之间的平衡[17]，促进动脉粥样硬化。上调LncRNA、Gas5和CIRC-ANRIL水平促进VSMC凋亡，减缓新生内膜增生(neointimal hyperplasia，NIH)[18]。

3 LncRNA与心脏病

哺乳动物早期胚胎存在3个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。中胚层组织可再分为体节、间介、侧板中胚层。肌肉、血管和成人的心脏是中胚层的主要衍生物。因为血管和心脏是同源组织，既然LncRNA可以参与调节血管动脉粥样硬化进程，必然可以通过多种机制调节心脏发育及衰老。

3.1 LncRNA与心肌细胞凋亡、心肌梗死

当心肌细胞长时间处于缺氧、缺血状态时，容易出现心肌梗死，并影响生存预后，LncRNA-MIAT(myocardial infarction-associated transcript，MIAT)，是心肌梗死的敏感位点，其在外周血的表达水平可以区分ST段抬高(低MIAT)和非ST段抬高性心肌梗死。同样，Li等[19]发现LncRNA-LIPCAR在ST段抬高性心肌梗死患者中含量升高。

LncRNA ANRIL通过调节miR-7-5p/SIRT1轴对缺氧诱导损伤H9c2细胞起保护作用。ANRIL通过与miR-7-5p竞争性结合，正向调节sirtuin 1(SIRT1)的表达。SIRT1表达增加可减弱miR-7-5p水平上调对缺氧H9c2细胞的损伤影响[20]。

阿托伐他汀(ATV)预处理间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)后得到的外泌体(exosomes，Exos)能促进内皮细胞功能而显著提高对急性心肌梗死的治疗效果[21]。进一步研究发现LncRNA H19至少部分通过介导MSCATV-Exo促进血管生成达到心脏保护作用。

在使用D-半乳糖诱导的新生大鼠心肌细胞衰老模型中，LncRNA H19水平下调[22]，提示了人为造成心肌缺血后的心肌保护功能丧失。进一步研究发现在缺氧环境中，H19表达沉默后，miR-29b-3p水平相对增加，心肌细胞衰老损伤情况进一步恶化。综上所述，LncRNA H19或许通过外泌体作用于下游miRNA通路从而保护心肌细胞。相对而言，来源于脐带间充质干细胞(UMSC)的外泌体释放的LncRNA MALAT1能抑制NF-κB/TNF-α信号通路，增加端粒长度，延缓衰老引起的心脏功能障碍。

主要在心肌细胞中表达的高度保守的LncRNA NR_045363在7日龄小鼠心脏中过表达可以刺激心肌梗死后心肌细胞再次增殖。特异性敲除NR_045363后抑制原代胚胎心肌细胞的增殖，LncRNA NR_045363主要通过与miR-216a相互作用，进一步调节JAK2-STAT3途径促进心肌细胞的DNA合成和胞质分裂[23]。

3.2 LncRNA与心肌纤维化

心肌中正常心肌细胞因处于缺血、缺氧环境而减少后，成纤维细胞活化异常增殖，通过成纤维作用生成心肌细胞外基质并过度沉积，且伴随着Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白比例升高。心肌纤维化是心室重构的主要病理表现，最终导致心肌收缩和舒张能力下降，影响心电传导。心肌纤维化是伴随多种心脏疾病的终末表现形式，如冠心病、高血压、心律失常等。

研究表明，LncRNA生长特异性阻滞因子5(GAS5)表达升高时可下调miR-21的表达，miR-21在心脏纤维化组织以及活化的心脏成纤维细胞中过度表达，对心脏纤维化进展有着促进作用[24]。miR-21表达下降抑制了心肌纤维化进程。此外，在心脏成纤维细胞中，miR-21也能对GAS5产生负调控的作用。

3.3 LncRNA与心肌肥厚

生理或病理性刺激使心脏压力或容积负荷增加，心肌细胞坏死、凋亡和纤维化，引起心肌重构进一步导致心肌肥厚。心脏肥大伴适应不良的心脏重塑是导致心力衰竭的最危险因素。研究表明，LncRNA在心脏重构调控中扮演着至关重要的角色。对心肌细胞能量代谢、心脏结构和功能的改变有着调节作用。

心肌细胞肥大时刺激LncRNA-CYTOR表达水平显著上调[25]。研究表明，LncRNA-CYTOR能作为miR-155的ceRNA减少miR-155诱导的抑制IKBKE效应。而CYTOR基因敲除后可加重主动脉缩窄诱导的心肌肥大或AngⅡ诱导的心肌肥大。

心肌肥大相关表观遗传调节因子LncRNA-Chaer[26]直接与多克隆抑制复合物2(PRC2)作用，抑制参与心肌肥大的基因启动子区的组蛋白H3-赖氨酸27甲基化，对心肌肥大有促进效果。

LncRNA Chast(心肌肥大相关转录本)通过抑制Pleckstrin同源性含域蛋白M家族成员1而阻止心肌细胞自噬并驱动心肌肥大发生[27]。

LncRNA-Mhrt(myosin heavy chain associated RNA transcript，肌球蛋白重链相关RNA转录本)通过与miR-145a-5p直接结合或与KLF4形成复合物抑制KLF4(Kruppel-like factor-4)磷酸化，从而促进具有调节内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和分化作用的KLF4表达，阻止ERK与KLF4的结合，降低了肌钙蛋白的表达，从而抑制心肌肥厚[28]。

LncRNA与心肌肥厚之间有着丝丝缕缕的相互关系，或是促进，或是阻抑，调节相关LncRNA表达对防止心肌功能进一步恶化有着重要的意义。

3.4 LncRNA与扩张性心肌病

扩张性心肌病可在任何年龄诊断，但大多数发生在30至40岁之间。扩张性心肌病是以左室、右室或双心腔扩大和舒缩功能障碍为主要特征的复合型心肌病。

Zhang等[29]选择816名冠心病患者和266名对照者作为研究对象，先采用基于微阵列的循环LncRNA图谱分析筛选出待排查的LncRNA，然后采用qRT-PCR检测病例及对照组血浆中LncRNA的表达情况，使用受试者工作特征曲线分析相关LncRNA对冠心病的鉴别诊断价值，通过Spearman相关分析研究队列发现与左心射血分数(LVEF)、左室舒张末期直径(LVEDD)以及血浆N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)心功能指标呈负相关的LncRNA ENST00000507296。当循环中LncRNA ENST00000507296水平越低，扩张型心肌病患者生存率越高。而LncRNA ENST00000532365表达水平与心功能呈正相关。基于微阵列的循环LncRNA分析发现，和对照组相比，扩张性心肌病患者循环中LncRNA ENST00000507296、LncRNA ENST00000442293和LncRNA ENST00000545794含量分别增加了198%、49%和76%。另一方面，LncRNA ENST00000532365、HMl LncRNA1548分别降低了46%和40%。这些差异表达的LncRNA有可能成为新的预测扩张性心肌病的标志物以及潜在治疗靶点。

当扩张型心肌病进一步恶化时，心肌细胞发生坏死、数量减少、炎症细胞浸润、心肌间质增生、纤维化加重等一系列病理生理改变，促成了心肌重构，最终导致心力衰竭。

3.5 LncRNA与心力衰竭

LncRNA作为新兴的心血管疾病的生物标志物与心力衰竭的诊断和预后判断密切相关。心肌梗死患者的外周血中，HIF-1α、KC-NQ1OT1、MALAT1含量增加，ANRIL含量下降，其表达变化在ST段抬高型心肌梗死与非ST段抬高型心肌梗死中也有不同。血浆LncRNA LIPCAR水平在射血分数降低心力衰竭(HF)患者中升高，并且和左心室重塑及心血管不良预后相关[30]。

在与对照组对比中发现，慢性心力衰竭患者LncRNA GASL1水平下降[31]。LncRNA GASL1表达增加时可抑制TGF-β1从而抑制心肌细胞凋亡，改善心力衰竭状况。另外一种LncRNA CPR(cardiomyocyte proliferation regulator,心肌细胞增殖调节因子)作用于DNA methylation machinery(DNMT3A,DNA复制和细胞周期进程的启动者)并将其募集到其启动子半胱氨酸-磷酸-鸟嘌呤位点来抑制心肌细胞的增殖，对心脏修复具有负性调节作用[32]。Hua等[33]使用免疫组织化学和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测发现，血浆中LncRNA COL1A1 ≥ 256.5 ng/mL和心力衰竭心脏移植术后1年内低存活率相关[HR：7.4，95%CI：3.5～15.8，Log rankP<0.01]。

过表达Lnc DACH1抑制了小鼠心尖切除术后心肌细胞再生导致的心脏功能恶化。特异性敲除LncDACH1或通过腺病毒介导沉默LncDACH1，幼年和成年小鼠心肌梗死后的心肌细胞增殖潜能被重新激活，并进一步促进心肌再生。进一步研究发现LncDACH1通过参与蛋白磷酸酶1催化亚基α(protein phosphatase 1 catalytic subunit alpha，PP1A)/yes-相关蛋白1(yes-associated protein 1，YAP1)信号通路抑制心肌细胞再生[34]。

监测血液中的LncRNA含量，敲除相关抑制再生的LncRNA无疑对心力衰竭有着积极的改善作用。

3.6 LncRNA与糖尿病心肌病及焦亡

目前发现细胞主要有3种死亡模式：程序性凋亡、自噬和坏死。之前有研究发现，LncRNA Neat1在缺血再灌注处理的糖尿病大鼠心肌组织中高表达。Neat1的过表达促进了乳酸脱氢酶、肌酸激酶和肌酸激酶-MB的产生，LncRNA Neat1通过上调Foxo1表达水平加重缺氧复氧损伤，促进心肌细胞自噬和凋亡，导致心肌梗死面积增加[35]。丁酸钠可显著降低7-Ket(7-酮胆固醇)或CHC(胆固醇晶体)诱导的NLRP3炎症小体的形成和激活，进一步抑制冠状动脉内皮细胞中半胱天冬酶-1的表达[36]。从而改善糖尿病大鼠主动脉内皮功能障碍，减轻内皮氧化应激损伤[37]

新近研究认为，焦亡同样在心血管疾病病理性发生发展过程中扮演着重要角色。细胞焦亡本质上是细胞炎性坏死，也是一种程序性细胞死亡[38]。

糖尿病心肌病(DCM)可引起心力衰竭、心律不齐和猝死等后果。细胞焦亡参与了DCM相关病理性进展改变，GSDMD(Gasdermine D)是焦亡的执行者，也是半胱天冬酶-1(Caspase-1)作用的底物。GSDMD被Caspase-1切割成GSDMDN的N端蛋白水解片段(GSDMDN)，在细胞膜上形成孔隙，细胞不断胀大直至膜破裂，释放大量的促炎细胞因子如IL-1β等，进一步激活级联的炎症反应[39-41]。最终会影响心肌细胞线粒体更新，导致心脏能量供给失调。

LncRNA KCNQ1OT1在糖尿病患者、高糖诱导的心肌细胞模型和糖尿病小鼠心肌组织中表达增加。KCNQ1OT1通过靶向结合miR-214-3p和Caspase-1介导下游焦亡通路，与焦亡的执行者GSDMD之间可能存在着密切的联系。此外，沉默KCNQ1OT1表达后，miR-214-3p上调，从而抑制Caspase-1表达，减少细胞死亡、细胞骨架结构异常和体外钙超载情况，改善心脏功能[42]。

通过调节心脏相关LncRNA的表达水平，能够为糖尿病及缺血性心肌病提供新的治疗策略。

4 展望

LncRNA分子结构稳定、种类多样，并具有很强的细胞和组织特异性以及发育阶段的特异性表达[2]。随着LncRNA与心血管疾病之间的潜在联系不断被发掘，LncRNA不再仅仅是以前所认为的基因垃圾。通过采用高通量测序技术及生物信息手段，不仅能在多种体液环境中检测到LncRNA，并且LncRNA不易被降解。越来越多的研究注意到LncRNA在表观遗传、基因转录和翻译表达水平上，通过不同的作用靶点及作用途径参与心血管疾病的发生发展。

然而目前研究主要集中在动物模型中，采用质粒构建或者病毒转染提高LncRNA的表达，或者使用干扰RNA技术降低LncRNA的表达[43]，通过升高或者降低LncRNA的水平来调节mRNA的表达，从而达到减少心血管损伤的目标。从动物试验到人体试验仍需要一段过程，LncRNA作用机制多样，深入研究LncRNA治疗方案能为未来干预基因相关性心脏疾病提供坚实的基础。

综上所述，LncRNA作为一种新近被发现的心血管中的生物标志物与基因治疗靶点，LncRNA对心血管疾病的调控机制复杂多样，同一LncRNA可能参与多种心血管疾病，一种心血管疾病可能由多个LncRNA及其下游通路参与调节。寻找各个疾病的确切靶位点及其调控机制仍需要大量的研究工作，随着LncRNA及其调控靶点在心血管疾病中的作用机制不断明确，在提示相关心血管疾病进展方面显示出了巨大希望。LncRNA将为心血管疾病的诊断和治疗提供新的理论指导及治疗方向，将其应用于临床势必有着远大的前景。