鸡血藤地榆黄酮提取物清除羟自由基作用的研究

林弘 林国卫

摘要：以鸡血藤和地榆为材料，采用超声波辅助浸提法提取黄酮，并用分光光度法测定其含量，将提取的黄酮进行羟自由基清除作用试验。结果表明鸡血藤黄酮提取率为3.49%，鸡血藤地榆混合物黄酮的提取率为4.56% ，羟自由基的清除率的IC50值分别是0.4188mg/ml和0.1448mg/ml。鸡血藤地榆黄酮的提取液具有更好的羟自由基的清除效果。

关键词：鸡血藤;地榆;黄酮;羟自由基

【中图分类号】R97             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）13--01

鸡血藤为豆科植物，其干燥藤茎是一味中国传统活血化瘀的中草药。它味苦微甘，具有降血压和抗脂质过氧化的双重功效，其根及茎具有活血舒筋，养血调经的功效[1] 。地榆是蔷薇科植物，属多年生草本植物，根入药，性微寒、味苦，它具有止血凉血、清热解毒 、收敛止泻及抑制多种致病微生物和肿瘤的作用[4]。因黄酮类化合物是鸡血藤和地榆的主要生理活性物质，所以研究其黄酮类化合物具有重要意义。

在黄酮类化合物的提取研究方法中因为超声提取法具有速度快、能耗低、不破坏有效成分的特点，所以文以超声波辅助乙醇浸提法提取黄酮，并进一步探讨它们对羟自由基的清除作用。

1.材料与试剂

1.1材料：鸡血藤、地榆购于百草堂中药店。

1.2试剂与仪器

芦丁标准品（BR 上海展云化工有限公司） 无水乙醇（AR 西陇化工股份有限公司 ）、硫酸亚铁（AR 西陇化工股份有限公司 ）、水杨酸（AR 中国医药集团上海化学试剂公司）、亚硝酸钠（AR国药集团化学试剂有限公司）、硝酸铝（AR上海实验试剂有限公司）。

RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、DHG-914DA电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、UV-2012PC紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）、SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、AL104电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、HH-6数显恒温水浴锅（国华有限公司）。

2方法

2.1标准曲线的制作

标准溶液配制：精密称取芦丁标准品10mg，用75%的乙醇定容至100ml容量瓶中。得到0.1mg/ml的标准溶液。采用Rice-Evans C.A.的方法制作标准曲线[5]。在510nm的波长下测定吸光值，以对照芦丁浓度c（mg/ml）为横坐标，以吸光度（A）作为纵坐标，得到标准曲线。

2.2黄酮的提取

将材料粉碎，鸡血藤地榆按4：3混合，恒温干燥后待用。称取材料10g于三角瓶中，按料液比1：20（w/v）加入200ml 60%的乙醇，超声波提取条件为200W 60℃ 2hr。过滤后将滤渣重新提取一次。合并两次滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇，得到浸膏，用95%的乙醇稀释定容至100ml，即为样品液[6-7]。

2.3黄酮的测定

取上述樣品液1mL用60%乙醇定容至10ml。将样品液替代标准溶液按2.1的方法测定，得到OA值，代入标准曲线方程中，计算样品液质量浓度C[8]。总黄酮提取率计算公式为：W=C·F·V/（1000·M）·100%       （1）

其中C为样品液质量浓度，F为溶液的稀释倍数，V为溶液的体积，M为样品的质量。

2.4 回收率实验

精密量取样品液1.0 ml，加入芦丁标准品1.0 ml，参照样品测定方法，测定吸光度，求出回收率为99.94%。

2.5羟自由基的清除率

根据fenton反应体系：H202+Fe2+    Fe3++OH-+.OH  来进行试验，得出数据。先取8根试管分别加入硫酸亚铁，水杨酸，乙醇，样品液，蒸馏水，过氧化氢，放在37℃下反应30分钟，在510nm的波长下测吸光度[9]。清除率计算公式如下：

清除率=[A0-（AX-AX0）]/A0*100%           （2）

其中A0为空白对照溶液吸管度，AX为样品液吸光度，AX0为不加过氧化氢样品液的本底吸光度[10]。

3、结果与讨论

3.1芦丁标准曲线

根据测定不同浓度芦丁对照品的吸光度值，绘制出标准曲线图，试对数据进行分析，测得浓度与吸光度的关系曲线的回归方程式：y=8.7286x - 0.0016，相关系数R2=0.9989。

3.2黄酮的提取率

根据标准曲线的回归方程和提取率的公式（1），经计算鸡血藤样液总黄酮含量为0.349mg/ml，提取率为3.49%;鸡血藤地榆总黄酮含量为0.456mg/ml，提取率为4.56%。

3.3羟自由基的清除率

依照2.5的方法，测得A0、AX、AX0，根据计算公式（2），得到样液羟自由基的清除率以及IC50 值[2-3]。

样液浓度0.1396mg/ml时，清除率为19.7%，样液浓度0.2792mg/ml）时，清除率为34.5%，样液浓度0.4188mg/ml时，清除率为 50.1%。鸡血藤黄酮提取液清除羟自由基的半效值IC50=0.4188mg/ml。

混合物黄酮样液为0.0228mg/ml时，清除率为8.3%;样液为0.0684mg/ml时，清除率为24.3%;样液为0.2052mg/ml时，清除率为70.5%。样液浓度为0.1448mg/ml时，清除率为50%，即IC50值=0.1448mg/ml。

4讨论

采用超声波辅助乙醇浸提法提取黄酮的效果显著，鸡血藤地榆提取物中含有丰富的黄酮类化合物，提取率为4.56%。

鸡血藤黄酮提取液清除羟自由基的半效值为0.4188mg/ml，鸡血藤地榆黄酮提取液清除羟自由基的半效值为0.1448mg/ml。与维生素C的IC50值0.23mg/ml[11] 比较：鸡血藤黄酮的IC50>维生素C的IC50值>鸡血藤地榆黄酮IC50，说明鸡血藤地榆混合物具有优于Vc 的清除羟自由基的功效。以上研究结果为中药鸡血藤地榆的应用提供了科学依据。

参考文献：

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课题 江西省教育厅科技项目，编号：GJJ13709