利用小RNA深度测序技术鉴定上海地区‘红美人’柑橘病毒种类

张丽勍 管丽琴 蒋飞 方献平 李水根 张学英

摘要 ：为明确上海地区‘红美人’柑橘的病毒种类，2020年4月在崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东采集疑似病毒感染的叶片样品11份，采用小RNA深度测序技术结合RT-PCR对不同来源的混合样品进行病毒种类鉴定。结果表明，样品中含有柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）、柑橘樹皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid（CBCVd）和柑橘类病毒Ⅴ Citrus viroid V（CVd-Ⅴ）。同时发现，上海地区‘红美人’柑橘病毒复合侵染现象普遍。基于CTV和CYVCV的CP全长基因及CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组序列系统进化分析结果表明：除了CYVCV的分离物与地理来源具有明显的相关性外，其余病毒及类病毒均没有严格的地域相关性。研究结果为开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。

关键词 ：柑橘; 小RNA深度测序; 病毒鉴定

中图分类号：

S 436.66

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020448

Identification of the viruses from Hongmeiren citrus in Shanghai by small RNA sequencing

ZHANG Liqing1，2#， GUAN Liqin3#， JIANG Fei4， FANG Xianping1，2， LI Shuigen1，2， ZHANG Xueying1，2*

（1.Forest & Fruit Research Institute， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 201403， China;

2.Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology， Shanghai 201403， China;

3.Shanghai Jiading District Agricultural Technology Extension Service Center， Shanghai 201800， China;

4. Shanghai Citrus Research Institute， Shanghai 201913， China）

Abstract

To identify the viruses and viroids from ‘Hongmeiren’ citrus in Shanghai， 11 citrus leaf samples with the virus-like symptoms were collected from the districts of Chongming， Jinshan， Fengxian， Jiading， Minhang and Pudong in April， 2020.The samples were analyzed by small RNA deep sequencing.The results showed that Citrus tristeza virus （CTV）， Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）， Citrus bark cracking viroid （CBCVd） and Citrus viroid V （CVd-Ⅴ） were detected in the samples by small RNA sequencing， which were confirmed by RT-PCR.The mixed infection of viruses/viroids was common in ‘Hongmeiren’ citrus.Phylogenetic analysis was conducted based on the full-length CP gene sequences of CTV and CYVCV， and the full-length genome sequences of CBCVd and CVd-Ⅴ， respectively.The results revealed that only CYVCV showed an obvious correlation with geographical origin.The study laid a foundation for the development of viral diagnosis and prevention in ‘Hongmeiren’ citrus seedlings.

Key words

citrus; small RNA sequencing; virus identification

柑橘是我国的重要经济作物，栽培主要采用无性繁殖的方法，在田间极易感染病毒类病害[1]。柑橘病毒类病害是柑橘病毒病和类似病毒病害（类病毒等）的统称[2]。目前，我国从柑橘上鉴定出的病毒主要有：柑橘衰退病毒Citrus tristeza virus（CTV）、柑橘黄化脉明病毒Citrus yellow vein clearing virus （CYVCV）、柑橘碎叶病毒Citrus tatter leaf virus （CTLV）等[3];类病毒有8种：柑橘裂皮类病毒Citrus exocortis viroid （CEVd）、柑橘曲叶类病毒Citrus bent leaf viroid （CBLVd）、啤酒花矮化类病毒Hop stunt viroid （HSVd）、柑橘矮化类病毒Citrus dwarfing viroid （CDVd）、柑橘树皮裂纹类病毒Citrus bark cracking viroid （CBCVd）（曾用名Citrus viroid Ⅳ，CVd-Ⅳ）、柑橘类病毒Ⅴ Citrus viroid Ⅴ （CVd-Ⅴ）、柑橘类病毒Ⅵ Citrus viroid Ⅵ （CVd-Ⅵ）和柑橘类病毒Ⅶ Citrus viroid Ⅶ，（CVd-Ⅶ）[47]。

‘红美人’（又名‘爱媛28’），是从日本引进的橘橙类杂交品种，由‘南香’（母本）和‘天草’（父本）杂交而成。该品种有甜橙香气，果面橙红色，果肉柔软多汁，深受消费者喜爱[8]。近两年因其品质优良，在上海柑橘产区发展较快。但是在生产上也出现了一些问题，调查发现，目前‘红美人’柑橘种苗市场鱼龙混杂，种苗疏于管理，极易导致病毒类病害的发生。小RNA测序技术（small RNA sequencing， sRNA-seq）于2009年开始出现，该技术可获得病毒的大量 sRNA序列，经生物信息学分析能高效鉴定病毒种类，易于发现新病毒或新分离物，且可同时鉴定多种RNA或DNA病毒，已被广泛应用于植物病毒检测[9]。本研究采用小RNA测序技术结合RT-PCR方法对样品进行检测，初步明确了侵染上海地区‘红美人’柑橘的主要病毒种类及其复合侵染的情况，研究结果可为后续开展‘红美人’柑橘种苗病毒检测及病毒病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘红美人’柑橘病叶于2020年采自上海‘红美人’柑橘主栽区崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东6区共11份样品，采集信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 小RNA深度测序与生物信息学分析

将表1中疑似病毒病症状叶片混样，分为CT1样品（编号C1～C4）、CT2樣品（编号C5～C7）和CT3样品（编号C8～C11）（表 1）。利用TRIzol Reagent（Invitrogen）提取叶片总RNA，采用TruseqTM Small RNA Sample Prep Kit（Illumina）构建3个cDNA文库。Hiseq2000测序平台进行深度测序。建库和测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

生物信息学分析：采用Fastx-Toolkit软件对原始数据进行质量控制，获得clean reads用于序列拼接组装，通过从头组装生成重叠群（contig）和单一序列（singleton），将拼接结果与病毒数据库（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/）进行BLASTn比对，将得到的病毒序列进行统计并注释。

1.2.2 柑橘病毒的RT-PCR检测

根据小RNA测序分析得到的结果，选取丰度较高的10种病毒及类病毒（表2），采用One Step RT-PCR Kit（TaKaRa）进行RT-PCR扩增，引物序列及反应条件见表2。RT-PCR扩增产物回收并克隆至pMD19-T载体上，选取阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.3 CTV和CYVCV病毒CP基因克隆及系统发育分析

设计并合成引物CTV-CP-F/CTV-CP-R和CYVCV-CP-F/CYVCV-CP-R，分别扩增CTV和CYVCV的CP基因开放阅读框（open reading frame，ORF），引物序列及反应条件见表2。RT-PCR扩增、产物克隆测序参照1.2.2。利用MEGA 7.0.26软件中的邻接法（neighbor-joining，NJ）分别对CTV和CYVCV的分离物（表3）进行系统发育树的构建，bootstrap值设置为1 000。

1.2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ系统发育分析

利用MEGA 7.0.26软件中的邻接法对1.2.2中RT-PCR得到的CBCVd和CVd-Ⅴ全长序列分别进行系统发育树的构建，方法参照1.2.3。

2 结果与分析

2.1 小RNA测序结果

3个混合样本CT1（编号C1～C4）、CT2（编号C5～C7）和CT3（编号C8～C11）分别获得22 727 867、25 438 222个和22 963 772个原始序列（raw reads），对raw reads进行质控，包括去除reads中的接头序列及由于接头自连等原因导致没有插入片段的reads等，3个混合样本分别获得clean reads 19 260 326、22 346 222个和20 566 427个，其长度分布见图1。其中，3个混合样本中长度为21 nt小RNA的clean reads所占比例最高，分别为26.00%、32.07%和31.20%。

提取长度为18～32 nt的序列进行拼接组装，拼接结果分别与植物病毒数据库进行比对，将得到的病毒序列进行统计并注释，结果如下：混合样本CT1得到5 642个contigs，包含349 885 bp，平均每个contig长62 bp，最长的contig为1 234 bp，GC含量为51.66%。其中165个contigs可以比对到8种病毒及类病毒（表3）;CT2得到5 691个contigs，包含360 490 bp，平均每个contig长63 bp，最长的contig为1 207 bp，GC含量为49.03%。其中166个contigs可以比对到8种病毒及类病毒（表3）;CT3得到6 726个contigs，包含441 185 bp，平均每个contig长66 bp，最长的contig为1 249 bp，GC含量为50.92%。219个contigs 可以比对到10种病毒及类病毒（表3）。

2.2 RT-PCR验证

为了验证小RNA深度测序结果的可靠性，对C1～C11号样品中的10种丰度较高的病毒及类病毒进行RT-PCR检测，对扩增到的特异性条带进行测序及进一步分析。结果表明：C1～C11号样品中共可检测出两种病毒及两种类病毒：CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ（图2）。其中样品C1仅检测出CTV;样品C5同时检测出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;样品C8同时检测出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;样品C9同时检测出CTV和CBCVd;样品C10同时检测出CYVCV和CBCVd（图2）。病毒及类病毒的检出率分别为27.3%（CTV）、18.2%（CYVCV）、36.4%（CBCVd）、27.3%（CVd-Ⅴ）。

RT-PCR产物测序发现：各样品中同种病毒或类病毒的扩增产物序列完全一致，样品中CTV序列与CTV-BaraoB-6（EU579362）外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列一致性为99.4%，将侵染上海‘红美人’柑橘的CTV命名为CTV-SH01;样品中CYVCV序列与CYVCV-YN-EL（KX156751）CP基因序列一致性为99.5%，将侵染上海‘红美人’柑橘的CYVCV命名为CYVCV-SH01;样品中CBCVd序列与CBCVd-C7-2（MG457786）基因组序列一致性为98.6%，将侵染上海‘红美人’柑橘的CBCVd命名为CBCVd-SH01;样品中CVd-Ⅴ序列与CVd-FE（JQ348927）基因组序列一致性为99.6%，将侵染上海‘红美人’柑橘的CVd-Ⅴ命名为CVd-Ⅴ-SH01。其中CBCVd和CVd-Ⅴ均为环状类病毒，通过背靠背引物扩增获得基因组全长序列，长度分别为284 bp和293 bp，测序验证后提交至NCBI，GenBank登录号分别MT780548和MT780547。以上结果与小RNA测序结果中高丰度contig序列一致。混合感染结果也说明：同一份柑橘样品能够同时被多种病毒及类病毒感染。

2.3 CTV和CYVCV CP基因的全长扩增和系统进化分析

分别扩增获得CTV-SH01和CYVCV-SH01的CP基因序列，长度分别为652 bp和978 bp（登录号：MT780545和MT780546）。为进一步明确CTV-SH01和CYVCV-SH01與已经报道的CTV和CYVCV分离物的进化关系，分别以同属长线病毒科Closteroviridae的甜菜黄化病毒Beet yellows virus和甲型线状病毒科Alphaflexiviridae的印度柑橘环斑病毒Indian citrus ringspot virus为外群构建了CTV和CYVCV的系统进化树。

结果表明：CTV-SH01分离物与美国T36（U16304）和埃及Qaha（AY340974）CTV分离物聚为一簇，亲缘关系较近。总体而言，没有严格的地域相关性（图3a）。CYVCV-SH01分离物与浙江分离物ZJ-4（KY933797）和ZJ-1（KY933794）聚为一小簇，与中国其他各地区分离物聚为一大簇，这些地区包括湖南、广东、重庆、四川，云南，浙江、江西等，其他国家包括印度和土耳其的分离物聚为另一大簇。因此，CYVCV的分离物具有明显的地域特异性（图3b）。

2.4 CBCVd和CVd-Ⅴ全基因组的系统进化分析

以苹果锈果类病毒属Apscaviroid的苹果锈果类病毒Apple scar skin viroid作为外群，构建了CBCVd和CVd-Ⅴ的基因组进化树。

对CBCVd的进化树分析结果表明，上海地区‘红美人’柑橘上的分离物（CBCVd-SH01）和古巴分离物Cu39（AJ630360）及日本分离物LE（AB054633）聚为一小簇，与其他国家如塞浦路斯、希腊、南非等国家以及中国其他地区分离物亲缘关系也较近，而与巴基斯坦的两株分离物亲缘关系最远（图3c）。

对CVd-Ⅴ的进化树分析结果表明：上海地区‘红美人’柑橘上的分离物CVd-Ⅴ-SH01与巴基斯坦两株分离物AL（JQ348931）和JK2（JQ348933）聚为一小簇，与中国其他地区分离物，例如浙江、重庆和湖南的分离物亲缘关系较远，与澳大利亚的两株分离物亲缘关系最远（图3d）。总体而言，基于全基因组的进化树分析结果表明：两种柑橘类病毒没有明显的地域特异性。

3 讨论

本研究利用小RNA深度测序技术对采自上海崇明、金山、奉贤、嘉定、闵行和浦东的‘红美人’柑橘叶片样品进行检测，通过提取叶片总RNA、构建小RNA文库并进行测序，生物信息学分析结合RT-PCR验证，明确了样品中存在CTV和CYVCV两种病毒及CVd-Ⅴ和CBCVd 两种类病毒。

CTV属长线病毒属Closterovirus，其引起的柑橘衰退病已经在全世界许多地区造成数百万棵柑橘树死亡[16]。柑橘属多数植物可被CTV侵染。不同柑橘产区分离的CTV分离物在致病性上有一定差异[17]。我国主要发生在中部和南部的柑橘属植物上[18]。不同的CTV株系可引起3种不同类型的症状：速衰型、茎陷点型和苗黄型[19]。本研究中主要采集的为叶片样品，C1、C5和C9样品中检测到CTV，叶片呈现黄化特征，根据症状可初步判定为苗黄型。CYVCV为印度柑橘病毒属Mandarivirus成员，我国于2009年首次发现[12]，其寄主范围较为广泛，可危害柠檬、酸橙及一些宽皮柑橘品种[20]。张艳慧等首次在浙江‘红美人’柑橘上检测出CYVCV，并且在这些植株中未检测到其他柑橘病毒[21]。CYVCV引起的症状主要为叶片卷曲黄化，后期叶片下卷、皱缩、畸形甚至嫩叶脱落，导致树势减弱[22]。本研究通过小RNA深度测序结合PCR验证证实C5，C8和C10样品中能够检测到CYVCV，且3份样品均表现明显的卷曲黄化，叶片皱缩，畸形和树势减弱的症状，这与已报道的CYVCV在易感品种上的症状一致，一方面证实鉴定结果准确，另一方面说明“红美人”柑橘也是CYVCV的易感品种之一。CTV和CYVCV传播途径相似，均可通过媒介昆虫和嫁接进行传播。本研究在上海地区‘红美人’柑橘叶片样品中同时检测出CTV和CYVCV，同时还检测到两种柑橘类病毒。刘惠芳研究发现CYVCV的群体进化关系与地理来源具有相关性，与寄主及品种相关性不明显[23]。本研究构建的CYVCV系统进化树结果显示，CYVCV的分离物具有明显的地域特异性，CYVCV-SH01分离物与浙江分离物聚为一小簇，与中国其他各地区分离物聚为一大簇。

CBCVd也称为柑橘类病毒IV（CVd-IV），属于马铃薯纺锤块茎类病毒科Pospiviroidae椰子死亡类病毒属Cocadviroid[24]。CVd-Ⅴ属于马铃薯纺锤块茎类病毒科苹果锈果类病毒属[7]。由于柑橘育苗多采用嫁接技术，在田间长期无性繁殖过程中往往存在类病毒混合侵染现象[25]，且由于柑橘类病毒复合侵染可能会产生协同效应，往往会使症状加重。将CVd-Ⅴ与CBLVd 或CVd-Ⅲ共同接种至指示植物‘Etrog’香橼上时，叶片症状更加明显，且植株出现明显的矮化现象[26]。柑橘类病毒与病毒也可互作产生协同作用，Lu等报道CTV与CDVd共侵染后有利于CDVd复制[26]。与CYVCV和CTV相比，CBCVd和CVd-Ⅴ等柑橘类病毒侵染许多柑橘属植物和柑橘近属植物时，并不引起明显症状[25]，但复合侵染时可能导致症状加剧，本研究中能检测到CBCVd、CVd-Ⅴ和CYVCV、CTV的复合侵染，这种复合侵染是否导致症状的加剧还有待进一步验证。

本研究發现，柑橘病毒和类病毒复合侵染在上海‘红美人’柑橘种植区发生普遍，样品C5同时检测出CTV、CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;样品C8同时检测出CYVCV、CBCVd和CVd-Ⅴ;样品C9同时检测出CTV和CBCVd;样品C10同时检测出CYVCV和CBCVd，这些结果说明柑橘病毒和类病毒混合感染的情况较为普遍，这些病毒与类病毒之间是否具有协同效应等相关机制需进一步研究。为保障上海地区‘红美人’柑橘产业持续健康发展，需加强种苗病毒检测，重视种苗质量的监督和管理，保障种苗来源。

参考文献

[1] 乔芬. 柑橘衰退病和碎叶病新型脱毒方法的研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2010.

[2] 赵学源， 蒋元晖. 柑桔病毒病和类似病毒病害的发生和防治[J]. 广西园艺， 2004， 15（5）： 410.

[3] 张艳慧， 刘莹洁， 金鑫， 等. 我国柑橘近年新发生的病毒及类似病害研究进展[J]. 果树学报， 2017， 34（9）： 147155.

[4] CHAMBERS G A， DONOVAN N J， BODAGHI S， et al. A novel citrus viroid found in Australia， tentatively named citrus viroid Ⅶ [J]. Archives of Virology， 2018， 163（1）： 215218.

[5] DURANVILA N， ROISTACHER C N， RIVERABUSTAMANTE R， et al. A definition of citrus viroid groups and their relationship to the exocortis disease [J]. Journal of General Virology， 1988， 69（12）： 30693080.

[6] ITO T， IEKI H， OZAKI K， et al. Characterization of a new citrus viroid species tentatively termed Citrus viroid OS[J]. Archives of Virology， 2001， 146（5）： 975.

[7] SERRA P， BARBOSA C J， DAROS J A， et al. Citrus viroid V： molecular characterization and synergistic interactions with other members of the genus Apscaviroid [J]. Virology， 2008， 370（1）： 102112.

[8] 曹锦萍， 陈烨芝， 徐淑婷， 等. ‘红美人’柑橘果皮失水对果实抗压和耐贮性的影响[C]∥中国园艺学会2019年学术年会， 2019.

[9] WU Qingfa， DING Shouwei， ZHANG Yongjiang， et al. Identification of viruses and viroids by next-generation sequencing and homology-dependent and homology-independent algorithms[J]. Annual Review of Phytopathology， 2015， 53（1）： 425444.

[10]BERNAD L， DURAN-VILA N. A novel RT-PCR approach for detection and characterization of citrus viroids [J]. Molecular and Cellular Probes， 2006， 20（2）： 105113.

[11]SERRA P， PINA J A， DURAN-VILA N. Identification and characterization of a variant of Citrus viroid Ⅴ（CVd-Ⅴ） in Seminole tangelo [C]∥International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings（1957-2010）. California： eScholarship， 2010.

[12]HILF M E， GARNSEY S M. Characterization and classification of Citrus tristeza virus isolates by amplification of multiple molecular markers [C]∥International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings（1957-2010）. California： eScholarship， 2010.

[13]CHEN Hongming， LI Zhongan， WANG Xuefeng， et al. First report of Citrus yellow vein clearing virus on lemon in Yunnan， China [J]. Plant Disease， 2014， 98（12）： 17471747.

[14]FU Shimin， SHAO J， ROY A， et al. Transcriptomic analyses reveal physiological changes in sweet orange roots affected by citrus blight [J/OL]. BMC Genomics， 2019， 20（1）： 969. DOI： 10.1186/s12864-019-6339-0.

[15]李敏， 周天宇， 吴佳星， 等. 柑橘鳞皮病毒 RT-LAMP 检测方法的建立与应用[J]. 园艺学报， 2019， 46（7）： 14091416.

[16]ATTA S， ZHOU Changyong， ZHOU Yan， et al. Distribution and research advances of Citrus tristeza virus [J]. Journal of Integrative Agriculture， 2012， 11（3）： 346358.

[17]BALLESTER-OLMOS J F， PINA J A， CARBONELL E A， et al. Biological diversity of Citrus tristeza virus （CTV） isolates in Spain [J]. Plant Pathology， 2010， 42（2）： 219229.

[18]WU Guanwei， PAN Song， WANG Guoping， et al. The genotypes of Citrus tristeza virus isolates from China revealed by sequence analysis of multiple molecular markers [J]. Archives of Virology， 2013， 158（1）： 231235.

[19]周彦， 周常勇， 王雪峰. 柑桔衰退病毒分离株分子特征初步研究[J]. 植物病理学报， 2005， 35（6）： 147150.

[20]赵恒燕， 关桂静， 周常勇， 等. 柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用[J]. 园艺学报， 2017， 44（7）： 14051414.

[21]张艳慧， 刘莹洁， 王琴， 等. 浙江柑橘产区柑橘黄脉病毒的发生、分布与分子特性研究[J]. 园艺学报， 2017， 44（10）： 19781984.

[22]NELGE N， BOZAN O， GK M， et al. Yellow vein clearing of lemons in Turkey [C]∥International Organization of Citrus Virologists Conference Proceedings （1957-2010）. California： eScholarship， 2010.

[23]劉惠芳. 柑橘黄化脉明病毒的遗传多样性及种群变异研究[D]. 重庆： 西南大学， 2018.

[24]SEMANCIK J S， VIDALAKIS G. The question of Citrus viroid Ⅳ as a Cocadviroid  [J]. Archives of Virology， 2005， 150（6）： 10591067.

[25]VERNIERE C， PERRIER X， DUBOIS C， et al. Interactions between citrus viroids affect symptom expression and field performance of clementine trees grafted on trifoliate orange [J]. Phytopathology， 2006， 96（4）： 356368.

[26]LU Rui， FOLIMONOV A， LI Wanxiang， et al. Citrus tristeza virus genome encodes three distinct suppressors of RNA silencing [J]. Phytopathology， 2004， 94（6）： S131.

（责任编辑：杨明丽）