概述基因工程中的工具酶

张淑萍

摘要催化特异性反应的工具酶在基因工程中发挥着重要的作用，根据其催化反应特性可分为限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和末端修饰酶4种类型。对这四种工具酶的发现和作用机制进行概述，并展望工具酶的应用前景。

关键词 限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 末端修饰酶

中图分类号Q-49文献标志码E

20世纪70年代，Paul Berg等人用限制性核酸内切酶（简称限制酶）将大肠杆菌（E.coli）的DNA切开后与病毒DNA连接，从而获得了第一个重组DNA分子，实现了化学水平上DNA分子的重新组合。虽然这并没有实现其遗传和增殖的生物学意义，但在这一思想的指导下，Cohen和Boyer于1973年开展了具有划时代意义的基因重组实验，为基因工程的诞生与发展奠定了重要基石。

基因工程从狭义上讲是指将载体与一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行拼接重组，然后导入另一种生物体（受体）内，从而按照人们的意愿改变并表达出新的性状。从广义上讲，基因工程是指基因操作原理和基因工程应用两部分，包括上游技术（即狭义的基因工程）和下游技术（即大规模培养重组外源基因的生物细胞以及分离纯化外源基因表达产物）。在基因操作过程中催化特异性反应的工具酶发挥着重要作用，根据其催化反应特性可分为限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和末端修饰酶4种类型。

1限制酶

1.1限制酶的发现

早在20世纪50年代初，科学家发现两种不同来源的λK和λB噬菌体分别可以高频感染它们各自的大肠杆菌K株和B株宿主细胞，当它们各自与其他宿主菌交叉混合培养时，感染频率会下降数千倍。λK噬菌体成功感染B株后，由B株繁殖出的λK后代在第二轮接种中便能像λB一样高频感染B株，但却不再有效地感染它原来的宿主K株。10年后，人们搞清了这个过程的分子机制。在1968年，人们采用分步纯化细胞提取物技术首次从E.coli中分离得到了限制酶。目前发现，限制酶广泛存在于原核生物中，在细菌中已發现1 200余种。

1.2限制酶的作用机制

根据限制酶的结构与作用方式，可将其分为Ⅰ类限制酶（TypeⅠ）、Ⅱ类限制酶（TypeⅡ）和Ⅲ类限制酶（TypeⅢ）3种类型。其中，Ⅱ类限制酶识别切割位点比较专一，且不具有甲基化酶的活性，在DNA重组中被广泛应用。而Ⅰ类和Ⅲ类限制酶由于在酶分子中包含限制性核酸内切活性和甲基化活性，因此被称为限制/修饰酶，具体见表1。

2DNA连接酶

2.1DNA连接酶的发现

1967年，三个实验室同时在大肠杆菌中发现了DNA连接酶，它连接DNA链上的5′-磷酸基团与另一DNA链的3′-羟基，生成磷酸二酯键，进而封闭缺口，在DNA的复制、重组和修复过程中发挥着重要的作用。根据催化过程中所需的能量来源可分为三磷酸腺苷（ATP）依赖型和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖型。迄今为止，DNA连接酶在病毒、细菌和真核生物体内均被发现，但NAD+依赖型未在真核生物中发现。

2.2DNA连接酶的作用机制

2.2.1ATP依赖型

一般动物细胞和噬菌体的DNA连接酶以ATP作为能量来源，可连接黏性末端和平末端，其作用机制分为三步：

①DNA连接酶在ATP和辅助因子Mg2+的作用下，形成酶-ATP复合物，ATP+DNA连接酶→酶-ATP+PPi。

②酶-ATP复合物上的AMP转移到DNA的5′-磷酸基团，释放出酶使其活化。

③活化的5′-磷酸基团与另一DNA链的3′-羟基生成磷酸二酯键，并释放出一磷酸腺苷（AMP），封闭缺口。

2.2.2NAD+依赖型

与ATP依赖型相比，只是第一步不同，NAD+依赖型的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，如大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶。与ATP依赖型相比，其参与的反应只是第一步不同，具体反应如下：

NAD++DNA连接酶→酶-ATP+NMN。

3DNA聚合酶

3.1DNA聚合酶Ⅰ

3.1.1DNA聚合酶Ⅰ的发现

1957年，美国科学家阿瑟·科恩伯格等人最先在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，并将其命名为DNA聚合酶I，其分子量为109 kD，是由约930个氨基酸组成的单肽链。

3.1.2DNA聚合酶Ⅰ的作用机制

DNA聚合酶I不参与复制延长过程，但在合成冈崎片段的过程中发挥着重要作用，可催化延长约20个核苷酸的DNA。同时校读复制中的错误，填补复制和修复中出现的空隙，具体过程如下：

①DNA聚合酶活性：以DNA单链为模板，在4种脱氧核糖核苷酸和引物存在下，使DNA链沿5′→3′方向延长；②3′→5′核酸外切酶活性：沿3′→5′方向识别和切除DNA复制过程中错配的碱基，起到校对作用，从而保证DNA复制的正确性；④5′→3′核酸外切酶活性：从5′端降解双链DNA或RNA，用于切除引物；⑤焦磷酸解作用：催化3′末端DNA分子发生焦磷酸解作用；⑥焦磷酸基交换：催化脱氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）末端的焦磷酸基和无机焦磷酸（PPi）交换。

3.2DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）

3.2.1DNA聚合酶Ⅰ大片段的发现

1970年，汉斯·克列诺于用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，原来的酶分子被切成76 kD和34 kD两个片段，其中大片段通常称为Klenow片段。它是由400个氨基酸形成α螺旋构型，其分子量是760 kD。

3.2.2DNA聚合酶Ⅰ大片段的作用机制

Klenow片段保持了DNA聚合酶Ⅰ中的DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性，但没有5′→3′核酸外切酶活性。

3.3Taq DNA聚合酶

3.3.1Taq DNA聚合酶的发现

1988年，Saiki等人从温泉中的水生噬热杆菌分离提取获得Taq DNA聚合酶，是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，其最适反应温度高达75～80℃，分子量为65kD。

3.3.2Taq DNA聚合酶的作用机制

Taq DNA聚合酶自一种耐热菌提取，广泛应用于PCR技术中，它具有5′→3′聚合作用（以DNA双链为模板，结合特定的引物后，以四种脱氧核苷酸为原料按照碱基互补配对的方式从5′→3′方向合成新的DNA链）和5′→3′核酸外切酶活性，但不具有3′→5′核酸外切酶活性。

3.4逆转录酶

3.4.1逆转录酶的发现

1970年，Temin H M等人在致癌RNA病毒中发现了逆转录酶（也称反转录酶），它是一种依赖RNA的DNA聚合酶。目前，科学家发现其也存在于其他细胞中，如烟草、蛙卵、哺乳动物分裂中的淋巴细胞和胚胎细胞等。

3.4.2逆转录酶的作用机制

逆转录酶是一种具有RNA指导下的DNA聚合酶活力、DNA指导下的DNA聚合酶活力和核糖核酸酶H（RNase H）活力的多功能酶，具体如下：

①RNA指导下的DNA聚合酶活力：催化以RNA为模板，在引物tRNA（主要是色氨酸tRNA）的3′-末端以5′→3′方向以dNTP为原料，聚合形成DNA的过程。由于其不具有3′→5′外切酶活性，因此无校正功能，催化合成的DNA具有较高的出错率；②DNA指导下的DNA聚合酶活力：催化以逆转录合成的第一条单链DNA为模板，以dNTP为原料，再合成第二条DNA分子的过程；③RNase H活力：在逆转录酶作用下合成的cDNA与模板RNA形成DNA-RNA杂合链，再发挥其RNase H活力水解掉RNA分子的5′端。

3.5末端转移酶

3.5.1末端转移酶的发现

1958年，Bollum等从小牛胸腺中纯化出末端转移酶，此后在烟草培养的细胞、骨髓中的前淋巴细胞及分化早期的类淋巴细胞中提取出了末端转移酶，其分子量为58.3 kDa，在辅因子Mg2+、Mn2+、Co2+等作用下，可加速其催化速率。

3.5.2末端转移酶的作用机制

和大多数的DNA聚合酶不同，末端转移酶是一种不需要模板的DNA聚合酶，其催化底物是带有突出、凹陷或平投3′-游离羟基末端的单双链DNA分子。末端转移酶在突出末端时，被Mg2+激活后，两条链的3′-端可以随机聚合脱氧核苷酸，而在平头或凹陷末端，被辅因子激活后，不按模板要求进行聚合反应。其反应过程需要的引物至少含有3个碱基短序列，可延长5～300 nt的长度。

4末端修饰酶

末端修饰酶包括多聚核苷酸激酶、碱基磷酸酶和S1核酸酶等，具体情况详见表2。

目前，基因工程改善着人们的生活，为医疗、农业、工业等领域创造了巨大的价值。在基因工程中工具酶扮演着关键角色，其制备、性质研究和市场买卖已经形成了一个巨大产业。在基因工程的实际操作中使用的酶远不止以上常用的工具酶。随着生物科学技术的发展，未来在基因操作中还会有新的酶不断参与进来并发挥重要作用。

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