UV-B预处理对拟南芥uvr8-2突变体响应干旱胁迫的影响

向 花，吕桂珍，李韶山

(生态与环境科学广东省普通高校重点实验室∥华南师范大学生命科学学院，广州 510631)

由于植物固着生长的特性，植物的生长发育过程中经常遭受多重环境逆境的影响. UV-B辐射通常伴随着高强度的光合有效辐射(PAR)，以及在一些地区还存在高温和干旱等环境因素，导致植物对UV-B辐射的响应可能与其它环境因素相互作用[1]. UV-B和干旱均能引起ROS、H2O2、NO的产生，并诱导ABA、乙烯、JA和SA的合成. 这些分子可能激活交叉反应中的防御机制，提高叶片的含水量，积累吸收UV-B的类黄酮、合成多胺、LEA蛋白和脱水蛋白以及上调酶和非酶抗氧化系统[2-4]. 在多种植物中发现UV-B能对植物的干旱响应产生影响. DRILIAS等[5]发现UV-B处理使夹竹桃叶片角质层厚度增加，减少了其在干燥夏季的表皮蒸腾作用. SCHMIDT等[6]发现UV-B诱导的叶片含水量的提高可能与渗透物质的产生和脱水蛋白的积累有关，而不是气孔关闭. HE等[7]发现UV-B预处理能增加小麦的抗旱能力，且干旱预处理也能增加小麦对UV-B的耐受性，表明干旱和UV-B之间存在交叉作用(Crosstalk of Stress Tolerance).

环境中UV-B(280～315 nm)辐射已经不仅是一种胁迫因子，更多的是作为一种信号参与植物生长、发育和代谢等各个方面. 植物暴露在UV-B辐射下会表现出叶片增厚、叶片数量减少、子叶卷曲、下胚轴伸长的抑制等[8]. RIZZINI等[9]发现UVR8蛋白是UV-B信号的光受体. UVR8蛋白由2个不同的结构域组成，包括由RCC1重复结构形成的一个7环的β螺旋核心结构域和C末端由27个氨基酸组成的C27结构域[10]. UVR8感知到UV-B信号后，迅速地由二聚体解聚为单体并进入细胞核[11]，通过C端的C27结构域与COP1(Constitutively Photomorphogenic 1)相互作用[12]，并调控下游HY5(Elongated Hypocotyl 5)、HYH(HY5-Homolog)以及一系列光形态建成基因的表达[13]，从而启动UV-B信号的转导. POULSON等[14]发现：在拟南芥中，UV-B诱导的抗旱性在生理水平上与保水性的提高，脯氨酸的含量升高和气孔导度降低有关，UVR8(UV Resistance Locus 8)为拟南芥感知UV-B信号的光受体，其在介导UV-B和干旱胁迫中是否发挥作用仍然未知.

uvr8-2是利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯诱变产生的突变体，其蛋白的C端缺乏C27结构域，不能与COP1发生相互作用[12].uvr8-2突变体缺乏UVR8介导的UV-B信号转导通路，有助于认识UV-B诱导的拟南芥干旱适应性与UVR8介导的UV-B信号通路的关系. 本实验室的前期研究证实STO/BBX24是细胞内UV-B信号转导的负调控因子[15]. 本研究利用uvr8-2突变体，研究其与野生型Ler在UV-B预处理后干旱胁迫下的表型、生理响应和相关基因表达量等方面是否存在差异，为认识UVR8在UV-B诱导的干旱适应性中是否发挥作用提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料与培养

植物材料为拟南芥(Arabidopsisthaliana)，野生型材料为Landsbergerecta(Ler)生态型，以及以Ler为背景的uvr8-2(爱尔兰科克大学Marcel Jansen惠赠). 种子于4 ℃黑暗春化处理3 d，用10%次氯酸钠表面消毒，播种于含有1%蔗糖、0.8%琼脂的1/2MS(Murashige and Skoog)培养基(pH 5.8)上，并置于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、PAR为60～80 μmol/(m2·s)的白光(Philips TLD30 W/865灯管, 由International Light 可见光光度计测量)下生长1周后，将拟南芥幼苗转移至土壤基质为V(营养土)∶V(珍珠岩)=1∶1、孔径为60 mm×60 mm、穴深60 mm的育苗盘中继续培养.

1.2 UV-B和干旱处理

光源来自Phlilips TL20 W/01 RS窄波段UV-B灯管，经醋酸纤维素膜(滤除292 nm以下波段)过滤后得到UV-B光源，实验设定的UV-B辐射强度为0.3 W/m2(由International Light UV-B 光度计测定). 经聚酯薄膜(滤除315nm以下波段)过滤后无UV-B光源，+/-UV-B下均附加10 μmol/(m2·s)光合辐射有效剂量的微弱白光.

取在土壤基质中生长2周后的拟南芥苗Ler和uvr8-2进行+/-UV-B处理1周后，将其置于白光下培养记为第1天，并各自分为正常浇水和干旱，实验共设4组：对照组、UV-B处理组、干旱组和UV-B+干旱组.

1.3 指标测定

1.3.1 相对含水量测定 待培养处理7 d后，称取植株相同部位的莲座叶0.1 g，采用复水法[16]测定相对含水量，计算公式为：相对含水量(%)=(Fw-Dw)/(Rw-Dw)，其中Fw、Dw、Rw分别为鲜质量、干质量和复水质量.

1.3.2 抗氧化酶系统测定 待培养处理7 d后，称取植株相同部位的莲座叶0.1 g，加入1 mL酶提取液(50 mmol/L PBS，0.1 mol/L EDTA，0.1% Triton X-100，2% PVP)研磨，离心后取上清液转移至离心管中并冰浴，即为待测酶液. 参考李合生[17]的方法测超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈创木酚法[18]测过氧化物酶(POD)活性，紫外分光光度法[19]测过氧化氢酶(CAT)活性，酶活性均以每克鲜质量酶单位表示.

1.3.3 细胞膜渗透率测定 待培养处理7 d后，称取植株相同部位的莲座叶0.05 g，细胞膜渗透率的测定采用相对电导率法[20].

1.3.4 激素含量测定 在干旱处理的第7、10、13天取样，称取干旱组和UV-B+干旱组的植株莲座叶各0.1 g，在1 mL预冷的磷酸缓冲液中研磨，转入2 mL离心管，4 ℃下8 000 r/min离心. 吸取上清液用Elisa试剂盒(深圳子科生物科技有限公司)测定脱落酸(Abscisic Acid, ABA)、茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)和水杨酸(Salicylic Acid, SA)3种激素的质量分数(以鲜质量计)，其具体测定方法参考试剂盒说明书. 试剂盒均采用酶联免疫吸附试验(Elisa)，颜色的深浅和样品中的激素呈正相关. 用酶标仪测450 nm波长下的吸光度，通过标准曲线计算样品的激素质量分数.

1.3.5 基因的表达量测定 取第7天干旱组和UV-B+干旱组植株相同部位的莲座叶0.1 g，液氮研磨后用RNAiso Plus (Takara, Japan) 进行RNA的提取，超微量紫外可见光分光光度计(Nanodrop-2000, Beckman, USA )检测RNA的质量，使用PrimeScriptTMRT Regent Kit with gDNA Eraser (Takara, Japan) 进行基因组DNA的去除和cDNA的合成，使用TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara, Japan)进行qPCR，并在QuantStudioTM6 Flex Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)上进行实时荧光定量PCR数据的采集. 采用△△Ct法，以Actin2作为内参基因标准化目的基因的表达. 利用Primer Premier 5设计目的基因引物，并由生工生物公司合成，其序列见表1.

表1 实时荧光定量PCR所用引物序列Table 1 Primers for real-time PCR

1.4 数据分析

计算各处理组3个重复样品的平均值和标准误，用绘图软件Origin 2017作图，采用SPSS 19进行显著分析，实验数据均采用单因素方差(ANOVA)分析，采用Duncan法进行多重比较，图中相同字母表示组间无显著差异，不同字母表示组间差异显著(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 UV-B预处理对拟南芥植株表型和相对含水量的影响

为保持土壤水分一致，将Ler和uvr8-2分列种植在同一穴盘中，实验结果发现：对照组和干旱组，即未经UV-B预处理的Ler和uvr8-2植株的生长状态相似，均为嫩绿色；UV-B和UV-B+干旱组，即UV-B预处理的uvr8-2植株呈现黄绿色；干旱7 d时，干旱组Ler和uvr8-2植株的叶片出现轻微的萎焉现象，但UV-B+干旱组无此现象；干旱14 d时，干旱组Ler和uvr8-2植株的叶片萎焉现象较为严重，植株组织失水而干枯，茎杆倒伏，但UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株仅出现叶片卷曲和轻微萎焉现象；待复水5 d后，植株重新吸收水分，干旱组Ler和uvr8-2植株已无法恢复生长，但UV-B+干旱组植株Ler和uvr8-2的茎杆挺直，正常生长(图1)，表明UV-B预处理能够提高拟南芥Ler和uvr8-2植株的干旱适应性.

奇数列的植株(1，3，5，7，9，11，13，15)为野生型Ler，偶数列的植株(2，4，6，8，10，12，14，16)为uvr8-2突变体

对照组和UV-B组的Ler和uvr8-2植株的相对含水量无显著性差异(图2)；干旱组和UV-B+干旱组叶片的相对含水量显著低于对照组和UV-B组；与干旱组相比，UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株的相对含水量分别提高了18.49%、8.97%，表明UV-B预处理可减缓干旱胁迫下拟南芥Ler和uvr8-2植株叶片的水分散失. UV-B+干旱组拟南芥Ler和uvr8-2植株叶片的相对含水量有显著差异，拟南芥uvr8-2植株比Ler植株相对含水量低12.71%.

图2 UV-B预处理对拟南芥叶片相对含水量的影响

2.2 UV-B预处理对拟南芥植株抗氧化酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)是植物逆境条件下保护细胞的重要酶类. 测定抗氧化酶活性发现(图3)：UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株的SOD、POD、CAT活性均显著高于干旱组，提高了26.03%～38.98%，表明UV-B预处理能增强拟南芥Ler和uvr8-2植株的抗氧化酶活性来应对干旱胁迫造成的氧化损伤. 而UV-B+干旱组拟南芥Ler与uvr8-2植株的SOD、POD、CAT活性有显著差异，UV-B+干旱组拟南芥uvr8-2的SOD活性比Ler植株低26.76%，但POD、CAT活性比Ler植株分别高1.33倍和23.84%.

2.3 UV-B预处理对拟南芥叶片细胞膜渗透率的影响

相对电导率表示电解质的渗漏量，体现细胞膜受损程度. 测定相对电导率发现：干旱胁迫处理显著增加了Ler和uvr8-2植株的相对电导率，其中干旱组的相对电导率最高，分别为34.73%和46.93%. 与干旱组相比，UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株的相对电导率显著降低，只有干旱组的45.92%、49.00%，表明UV-B预处理能降低干旱对拟南芥Ler和uvr8-2植株叶片造成的伤害. UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株的相对电导率存在显著差异，uvr8-2植株的相对电导率比Ler高30.65%(图4).

图3 UV-B预处理对拟南芥植株抗氧化酶活性的影响

图4 UV-B预处理对拟南芥叶片细胞膜渗透率的影响

2.4 UV-B预处理对拟南芥植株激素质量分数的影响

植物抵御干旱胁迫涉及多种激素共同作用，因此测定了干旱组和UV-B+干旱组拟南芥Ler和uvr8-2植株中ABA、JA和SA激素的质量分数(图5). 随着干旱时间的延长，干旱组和UV-B+干旱组拟南芥Ler和uvr8-2植株中w(ABA)、w(JA)和w(SA)均呈逐渐增加的趋势；且对同种植株，UV-B+干旱组的w(ABA)、w(JA)和w(SA)均显著高于干旱组，Ler和uvr8-2植株中w(ABA)的增幅分别为114.96%～127.27%、35.40%～86.91%；w(JA)的增幅分别为60.64%～77.82%、51.48%～90.83%；w(SA)的增幅分别为41.81%～58.94%、33.59%～46.83%，表明UV-B预处理能增强干旱胁迫下拟南芥Ler和uvr8-2植株中w(ABA)、w(JA)和w(SA)，有助于更好地应对干旱胁迫.

UV-B+干旱组Ler与uvr8-2植株的w(ABA)、w(JA)和w(SA)均有显著差异，uvr8-2植株的w(ABA)比Ler降低19.02%～21.81%；干旱胁迫13 d时，uvr8-2植株的w(JA)比Ler高22.34%；干旱胁迫7 d时，uvr8-2植株的w(SA)比Ler低8.13%(图5).

图5 UV-B预处理对拟南芥植物激素质量分数的影响

2.5 UV-B预处理对拟南芥植株抗氧化酶活性基因表达量的影响

检测干旱组和UV-B+干旱组植株的抗氧化酶活性基因POD和CAT的表达量发现(图6):UV-B+干旱组拟南芥Ler和uvr8-2植株的POD和CAT表达量均显著高于干旱组，UV-B+干旱组Ler和uvr8-2植株的POD表达量是干旱组的1.76、5.55倍，其CAT表达量分别是干旱组的1.41、2.02倍；而UV-B+干旱组uvr8-2植株的POD表达量是Ler植株的1.73倍，表明干旱胁迫下，UV-B预处理能诱导拟南芥抗氧化酶基因POD、CAT的表达，增强酶活性，从而提高植株体内活性氧的清除能力.

图6 UV-B预处理对拟南芥植株抗氧化酶基因表达量的影响

3 讨论

随着全球气候变暖，由干旱造成的损失日益加剧. 干旱使植物体内蛋白质和细胞膜结构发生改变，影响植物的生理生化功能，进而影响生长发育. 因此探索如何提高植株的耐旱性具有重要的应用价值. 提高植物耐旱性的方法，如接种丛枝菌根真菌(AMF)能增强耐旱性[21]，喷施黄腐酸(HA)能促进小麦叶片持水能力而增强耐旱性[22]，异源表达花生基因AhGLK1(ArachishypogaealL. Golden2-like 1)能提高拟南芥glklglk2突变体的抗旱性[23].

原先普遍认为UV-B是一种胁迫因子，UV-B下小麦的绿叶数目持续减少，生物量下降[24]，也会造成植物株高下降，节间缩短[25]. 越来越多的研究表明UV-B对植物的生长发育有重要的调节作用，如UV-B使杂草叶片蜡质大幅度增加，导致杂草对除草剂的抗性增强[26]. 每天6 kJ/m2UV-B处理的黄杉幼苗更能抗旱，因为其具有较低的蒸腾失水率，能维持更好的水分状况[27]. 与此一致，本研究发现UV-B预处理减轻了干旱引发的叶片萎焉卷曲现象，减缓了干旱胁迫下Ler植株叶片的水分散失，表明UV-B预处理能增强拟南芥Ler植株对干旱的适应性.

UVR8是目前已知的感知UV-B信号的唯一受体，利用UV-B光受体uvr8-2突变体，研究uvr8-2植株在UV-B预处理下的干旱响应，有助于认识拟南芥中UV-B诱导的干旱适应性与UVR8介导的UV-B信号通路的关系. 激素作为植物生长的调节剂，能参与植物对逆境的响应与适应过程. 本研究结果表明：干旱胁迫下，UV-B预处理均能增加Ler和uvr8-2植株的ABA、JA、SA质量分数，这与VANHAELEWYN等[28]发现UV-B增强环境胁迫诱导的防御激素的效应可独立于UVR8的研究结果一致. 在植物抵御干旱胁迫过程中，涉及多种激素共同作用. 李长宁[29]、刘杰等[30]研究表明ABA和SA能提高植株的抗氧化酶活性，提高清除活性氧的效率；KIM等[31]发现拟南芥能通过控制糖酵解转化为乙酸合成途径开关，调控下游JA信号通路，赋予植物干旱能力；SA处理能降低紫御谷叶片的相对电导率[32]；在UV-B处理的大麦幼苗中，增加叶片中的SA水平可以阻止在施加UV-B后缺水条件下叶片含水量的降低[33]. 由此表明：拟南芥中UV-B介导的干旱适应性中ABA、JA、SA发挥了关键作用，其引起抗氧化酶SOD、POD、CAT活性升高，抗氧化酶基因CAT和POD表达量也显著增加，活性氧清除能力提高，有助于减轻干旱胁迫下植物体内活性氧分子积累造成的细胞损伤，从而缓解干旱胁迫下拟南芥叶片萎焉、相对含水量下降等现象.

UV-B预处理均能提高拟南芥Ler和uvr8-2植株的干旱适应性，推测此过程中uvr8-2植株存在一条不依赖于UVR8的信号转导途径. 在干旱胁迫下，UV-B预处理的Ler和uvr8-2植株的响应有不同之处. UV-B+干旱组uvr8-2植株的相对含水量显著低于Ler，细胞膜渗透率显著高于Ler，表明UV-B预处理后拟南芥Ler可能比uvr8-2植株更能适应干旱. UV-B+干旱组uvr8-2植株的ABA质量分数显著低于Ler，JA质量分数显著高于Ler，表明在UV-B预处理提高Ler和uvr8-2植株的干旱适应过程中发挥关键作用的激素不同.

4 结论

研究结果表明：UV-B预处理既能诱导拟南芥野生型Ler对干旱的适应性，也能诱导uvr8-2突变体植株的干旱适应性. UV-B预处理通过增加植株体内ABA、JA和SA植物激素的质量分数，调控抗氧化酶基因CAT、POD表达和增强抗氧化酶活性，从而缓解干旱胁迫下拟南芥叶片萎焉、相对含水量下降等现象. 本研究揭示了UV-B预处理诱导拟南芥的干旱适应性存在不依赖于UVR8的通路，为深入研究UV-B提高拟南芥干旱适应性的分子机制提供依据.