病原真菌对琥珀酸脱氢酶抑制剂抗性研究进展

胡伟群

(浙江省化工研究院，杭州 310000）

农作物病虫害是影响农业持续和健康发展的重要制约因素。农药作为控制农林作物病虫草鼠等有害生物危害的特殊商品，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮油安全等方面发挥重要作用。近年来，SDHI类杀菌剂因结构新颖、活性高以及杀菌谱广等优势，受到各大农药公司的高度关注，她们投入大量精力和财力开发该类药剂。目前，有23个SDHI类杀菌剂品种已经上市，此类产品已成为市场销售额增长最为迅速的一类药剂，在防治各种重要植物病害中发挥重要作用。2016 年，SDHI类杀菌剂的全球销售额为 16.91亿美元，占全球杀菌剂市场销售额的11.%[1]。但是，随着SDHI类杀菌剂的大量使用，多种病原真菌已经对该类药剂产生了抗性，且抗性频率不断发展，这在一定程度上影响了该类药剂的防治效果。本文首先介绍 SDHI类药剂的作用机制，在此基础上，重点综述病菌对该类药剂抗性发生和发展情况，阐述抗性机制，进而讨论抗性治理策略。

1 SDHI类杀菌剂的作用机制

生物通过呼吸链进行呼吸产生生物能。通常情况下，真菌体内一个分子葡萄糖完全氧化为CO2和H2O时，在细胞内可产生36个ATP分子，其中32个是在呼吸链中通过氧化磷酸化形成的。因此，呼吸链是研发杀菌剂的重要靶标，抑制或干扰呼吸链的杀菌剂常常有很高的杀菌活性。

在真菌线粒体呼吸链上有 6个关键酶复合物(I到 VI)参与电子传递，并通过电子传递产生 ATP。在复合物 I中，电子从还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)传递到辅酶Q，该过程由NADH-Q还原酶催化。在复合物Ⅱ中，琥珀酸脱氢酶(SDH)催化琥珀酸形成延胡索酸以及从泛醌辅酶Q还原到还原型辅酶Q的偶联反应。然后，在辅酶Q细胞色素c氧化还原酶的催化下，辅酶Q或还原型辅酶Q将电子传递到细胞色素 bc1酶复合物(复合物III)。最后，细胞色素c将电子经过细胞色素a和a3氧化酶(复合物Ⅳ)传递到最终的受体O2。在特殊环境下，在真菌体内的电子能够绕过正常的呼吸路径，从辅酶Q传递到O2，这一途径对氰化物不敏感，由旁路氧化酶(the alternative oxidase，也称复合物V)催化，这种呼吸作用也称为旁路呼吸(alternative respiration)。在呼吸电子传递过程中，所释放的质子在几个不同的位点由ATP合成酶(复合物VI)催化，经氧化磷酸化产生ATP。

琥铂酸脱氢酶由黄素蛋白(SdhA)、铁硫蛋白(sdhB)和另外2种嵌膜蛋白(SdhC和SdhD) 4个亚单位组成。SdhA和SdhB组成该复合体的可溶性部分，具有琥珀酸脱氢酶活性；嵌膜蛋白SdhC和SdhD将SdhA和SdhB固定在内膜上，且具有泛醌还原酶活性[2]。SDHI类杀菌剂作用于琥铂酸脱氢酶，通过完全或者部分占据底物泛醌的位点，抑制了电子从琥珀酸到泛醌的传递，干扰呼吸链上复合体II电子传递，阻止其产生能量，进而抑制病原菌生长，最终导致病菌死亡[3]。药剂与药靶精细互作试验表明，SDHI的酸性部分插入琥铂酸脱氢酶的泛醌结合位点(Q位点)，与SdhC的R46和S42以及SdhB的I218和P169位氨基酸通过范德华(vdW)力相互作用；而药剂的胺基延伸到Q位的开口部，与SdHC的W35、I43以及I30氨基酸通过vdW相互作用；药剂的羰基氧原子与SdhB的W173和SdhD的Y91氨基酸互作；精细的药剂-药靶互作试验有助于设计更加高效的SDHIs新药剂[4-5]。

2 病菌对SDHIs抗性发生情况

尽管 SDHIs对多种病原菌有很高的抑菌活性，但由于药剂作用于琥铂酸脱氢酶这个单一的位点，而且该靶标蛋白存在较高的变异性，因此，国际杀菌剂抗性行动委员会[Fungicides Resistance Action Committee，FRAC(https://www.frac.info/)]将SDHI类杀菌剂归为中等至高抗性风险药剂。从1970年报道了第一个对SDHI类药剂抗性的真菌突变体以来[5]，随着SDHI类药剂的广泛应用，目前已经有20多种病菌对该类药剂产生抗性，其中16种病菌在田间已经对它们产生抗性(表1)。抗药水平及抗性频率因不同病菌-药剂组合而异。例如，SDHI类的啶酰菌胺 2005年在我国登记防治多种作物的灰霉病。2012-2013年测定发现，湖北不同地区草莓的灰霉病菌对啶酰菌胺抗性频率在0～4.76%[6-7]。Zheng等人报道从山东葡萄上分离的灰霉病菌对啶酰菌胺产生了严重抗性，抗性菌株比例达 100%[8]。因此，在今后一段时间，随着SDHI类药剂的广泛使用，我国灰霉病菌对该类药剂的抗性问题还会加重。

表1 目前已报道的对SDHI类杀菌剂产生抗性的病原真菌

3 病原真菌对SDHIs的抗性机制

研究发现，病原菌对SDHIs的抗性主要由琥铂酸脱氢酶复合体亚基上氨基酸突变所致。琥铂酸脱氢酶复合体亚基上的氨基酸突变，改变了药物与复合体的相互作用，降低药剂与药靶的亲和力，进而引起病菌的抗药性。目前，田间菌株对SDHIs的抗性主要由SdhB亚基突变所致。例如，灰霉病菌SdhB亚基上第 225、230或 272氨基酸位点分别发生P225L/F/T (第225位的脯氨酸突变成亮氨酸、苯丙氨酸或苏氨酸)、N230I (第230位的天冬酰胺突变成异亮氨酸)或 H272L/R/Y(第 272位的组氨酸突变成亮氨酸、精氨酸或酪氨酸)突变，导致灰霉病菌对啶酰菌胺产生不同水平的抗性[23-24]。例如，H272L点突变的灰霉病菌对啶酰菌胺表现高水平抗性，但对其他SDHI类药剂表现低到中等抗性；N230I点突变的灰霉病菌对啶酰菌胺、氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺表现中等抗性，对吡唑萘菌胺、联苯吡菌胺和萎锈灵等仅表现低水平抗性[25]。有趣的是，同一位点突变成不同的氨基酸，可以引起不同的抗性水平和抗性谱。例如，SdhB亚基上H272L的突变，使得灰霉病菌对所有 SDHI类药剂均产生抗药性；但H272Y的突变使得灰霉病菌对啶酰菌胺产生抗性，但对氟吡菌酰胺反而更加敏感[24]。目前，SdhB亚基突变引起多种病菌，包括Alternaria alternata、Alternaria solani、Corynespora cassiicola、Didymellabryoniae、Podosphaera xanthii、Sclerotinia sclerotiorum以及Stemphylium vesicarium等对SDHIs产生抗药性。

除了SdhB亚基发生突变之外，SdhC和SdhD亚基上突变同样引起SDHIs抗性问题。苹果黑星病菌(Venturia inaequalis) SdhC亚基第 151位发生H151R突变，导致病菌产生抗药性。番茄早疫病菌(Alternaria solani) SdhD亚基的第133位发生H133R突变，引起病菌对SDHIs的抗性。目前，尚未有SdhA亚基发生突变引起抗药性的报道。

最新研究还发现，小麦叶枯病菌群体中存在一类对SDHIs天然抗性的菌株，这些菌株在SDHI类药剂使用之前已经在自然界存在。对这类菌株的抗性机制研究发现，这类菌株中除了SdhC基因之外，还有一个SdhC的同源基因(命名为ZTDHC3)，该基因同样能够编码琥珀酸脱氢酶 C亚基(命名为alt-SdhC)。反向遗传学试验表明，alt-SdhC与正常的SdhC亚基一样，能够与其他3个琥铂酸脱氢酶亚基结合，形成功能完整的琥珀酸脱氢酶酶，并且alt-SdhC蛋白中独特的Qp位点残基使得这类菌株对SDHIs产生抗性[26]。这些结果表明，自然界中病原真菌对SDHI类药剂存在多种抗药机制。

4 SDHIs抗性治理策略

由于 SDHI类杀菌剂属于中高抗性风险药剂，在使用一段时候后，病菌比较容易对这类药剂产生抗性。因此，在使用药剂过程中，必须要进行抗性治理。抗性治理的基本策略包括⑴ 实施病害综合治理，降低病害压力；⑵ 同一个生长季节，要严格限制 SDHI类药剂的使用次数，且药剂应该在发病初期使用，减轻药剂对病菌群体的选择压力。以葡萄灰霉病为例，FRAC建议一个生长季节，一般情况下SDHI类药剂的使用不超过3次；在一个生长季节使用 12次以上药剂的地区，SDHI类药剂最多只能使用4次；而且SDHI类药剂需要和其他作用机制的药剂轮换使用，避免连续使用。⑶ 由于SDHI类药剂之间存在交互抗性，因此，药剂混用时，必须将不同作用机制的药剂进行混用，不能将 SDHI类药剂进行混用。⑷ 要加强病菌抗药性监测，及时了解抗性发生情况，并针对性地制定实施病害防控方案。⑸ 强化药剂抗性机制及构效关系研究，针对抗性突变位点，设计和研发反抗性或难以产生抗药性的新药剂，从而克服抗性问题。