基于Notch信号通路探讨中医药干预缺血性脑卒中的研究进展

周剑英，何思锦，顾力华，谢 青

缺血性脑卒中是由多种因素诱发脑组织局部血流灌注减少或完全中断，导致神经细胞处于缺氧缺血状态的神经内科常见疾病类型，病人主要临床表现为不同程度的神经功能损伤，如失语、偏瘫等[1]。流行病学报道显示，我国缺血性脑卒中发病率为2万～3万，而致死致残率为30%～40 %，病人出院后常合并肢体运动功能障碍，在影响自身工作生活质量的同时，亦给家庭和社会带来极大负担[2]。针对神经再生是缺血性脑卒中具有神经功能恢复的难点及核心问题，通过Notch信号通路，调节具有自我更新能力的神经干细胞的增殖和分化是脑缺血后神经再生的主要分子机制。近年来，由于中医药防治脑卒中具有不良反应少、疗效佳等优势，在急性期、恢复期的临床治疗中得到广泛应用。然而，其作用机制尚未明确，一定程度上限制了中医药在治疗缺血性脑卒中方面的发展[3]。因此，本研究从 Notch 信号通路对调节具有自我更新能力的神经干细胞的增殖和分化角度，探讨中医药治疗缺血性脑卒中的可能机制。

Notch基因于1917年被Morgan等发现，它的突变将导致果蝇翅膀出现缺口(Notch)，得名由此而来。Notch广泛存在于从无脊椎动物到哺乳动物等多个生物，并精确调控细胞增殖、分化、凋亡，在细胞生长和生理功能等方面发挥着重要作用，Notch信号通路在缺血性脑卒中发生、发展中发挥重要作用。

1 Notch信号通路概述

经过长期的进化，成熟的大脑使用了一系列通路来管理认知功能，例如Notch信号通路。Notch信号通路主要包括受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4)、配体(Delta like 1 即 DLL1、DLL3、DLL4 和 Jagged 1、Jagged 2)、CSL-DNA 结合蛋白以及其他效应分子和调节分子。Notch通路的多个组成部分在血管系统中表达，缺乏这些组成部分的小鼠表现出胚胎致死性和血管重塑缺陷[4]。经典的Notch信号通路的激活途径是通过相邻细胞的Notch配体与受体结合，Notch受体蛋白经过3次剪切，由胞内段(NICD)释放入胞质，形成NICD/CSL转录激活复合体，并进入细胞核与转录因子CSL结合，从而激活碱性-螺旋-环-螺旋转录抑制因子家族的靶基因(如Hes1、Hes等)发挥调节作用[5]。Notch 信号通路在神经干细胞增殖分化的调节中具有重要作用，是一条高度保守的信号转导通路。内源性神经干细胞增殖分化潜能为缺血性脑卒中神经修复与重塑提供了可能，Notch 信号转导通路对神经干细胞增殖分化具有重要调节作用[6]。

1.1 Notch信号通路对缺血性脑卒中神经分化与再生的影响 缺血性脑卒中发生后，会出现神经元肿胀，坏死甚至凋亡。1992年，Reynolds等先后从胎鼠和成鼠纹状体分离得到神经干细胞，哺乳动物“成年中枢神经系统不再具有神经细胞新生能力”的传统认识被打破。成年哺乳动物神经干细胞主要聚集区是中枢神经系统中侧脑室壁的脑室下区和海马齿状回的颗粒下层被证实[7]。Alhajzen等[8]通过小鼠缺血模型的研究发现，Notch配体DLL4在正常灌注的微血管内皮细胞中表达较弱，而缺血后在发芽的毛细血管最前端表达增强。DLL4-Notch信号通过干预血管分支形态发生来调节侧支血管的形成。DLL4还通过干预动脉功能和结构来影响血管灌注，其信号激活在再灌注期间血管分支的重组中非常重要[9]。脑缺血后恢复期神经再生是重要的环节，已有实验证明此过程中有Notch信号通路的参与，如果抑制Notch信号通路，脑内神经干细胞分化为神经元的过程也受阻，这表明脑缺血损伤后Notch信号通路被激活，并且在神经干细胞存活、增生和分化过程中均发挥重要作用[10]。郭娜等[11]通过建立PC12诱导的神经元样细胞氧糖剥夺(OGD)体外脑缺血模型，观察Notch受体在脑缺血损伤中的表达变化及其配体Jagged1对缺血损伤的影响，发现OGD的PC12 细胞在3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h的不同时间点Notch1 mRNA的表达量与正常组比较均明显升高；与对照组相比，外源性Jagged1干预可导致正常及缺血神经元的存活率下降，可见脑缺血损伤过程有Notch信号通路的参与。

1.2 Notch信号通路对脑缺血后血管损伤的影响 神经再生和突触发生的首要条件是微血管的新生，这对神经功能的恢复有决定性作用。内皮细胞增殖、迁移和重塑是血管新生的主要过程，涉及多条信号通路分子和生长因子，其中一条是Notch信号通路。血管内皮生长因子是血管生长因子中重要的一员，能增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖和血管形成[12]。有研究表明，Notch信号通路的配体 DLL4通过表达可抑制血管内皮生长因子信号，血管内皮细胞的增殖、迁移会因此减少。Kikuchi等[13]采用没有血管内皮生长因子诱导的小鼠后肢缺血模型，发现匹伐他汀可以通过Notch1介导血管生成和动脉形成。Notch信号通路可以调节血管生成下游的血管内皮生长因子和上游的肝配蛋白 B2(ephrin B2)，胚胎和产后体内的血管形成主要有内皮ephrinB2反向信号的参与。由此可见，Notch 信号通路是调控成年人血管新生的重要组成部分。

2 中医药治疗缺血性脑卒中Notch信号通路的相关研究

2.1 Notch 信号通路作用靶点的研究 研究显示，通过应用大脑中动脉阻塞术(MCAO)制备大鼠缺血性脑卒中模型提示，补肾生髓法和益气活血法两种中药复方能够抑制Notch信号转导通路Notch1、Jagged1 mRNA或蛋白的过高表达，增强额顶叶或海马CA1 区Notch3 mRNA及蛋白表达，促进脑卒中后神经细胞修复，影响神经干细胞的增殖和分化[14-15]。冯珂等[16]应用同样实验提示健脾益智胶囊可能通过增加 Notch1、Jagged1蛋白及基因的表达，以促进缺血后神经干细胞增殖分化。应用双侧颈总动脉结扎法制备血管性痴呆大鼠模型发现，首乌益智胶囊能保护神经元，维持海马神经细胞结构与功能的完整，减轻脑缺血对海马神经元的损伤，增加Notch 信号通路中Notch1、靶基因Hes3及转导-转录活化因子 Stat3 mRNA 的表达[17-18]。赵雅宁等[19]应用4-血管阻断法制备脑卒中大鼠模型，结果提示参芎化瘀胶囊可增加 Notch1、血管内皮生长因子蛋白的表达，提高神经细胞存活率，保护神经细胞的结构和功能。陈聘婷等[20]证明丹龙醒脑方能通过上调脑卒中大鼠海马区 Notch1、Notch2 及 Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表达水平，促进神经干细胞的增殖。张叶华[21]研究提示，补阳还五汤可能通过增强脑缺血后伴抑郁大鼠脑内Notch信号通路上Notch1、Jaggged1、Hes1及Hes5的表达，调节神经干细胞增殖分化。由此可见，应用补肾益气、活血化瘀等中医药对治疗缺血性脑卒中有一定的疗效，其作用机制与Notch信号通路的调控作用相关。

2.2 Notch信号通路对脑缺血性细胞凋亡的影响 目前已知调节细胞凋亡的途径主要有线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路3种。大量研究已证实，局灶性脑缺血后所发生的神经元凋亡主要通过以下两种途径：由Bc1-2家族基因、Caspase家族基因参与的以线粒体为中心的内源性凋亡途径；由Fas基因参与的以死亡受体为介导的外源性凋亡途径[22]。因此，对上述细胞凋亡基因的干预可作为脑缺血治疗的潜在靶点。现阶段针对中医药干预缺血性脑卒中细胞凋亡的研究主要集中在动物实验领域，临床研究开展相对较少。闵珉[23]通过对银杏叶提取物对全脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用的实验研究证实，银杏叶提取物中的有效成分EGb761可抑制全脑缺血及其再灌注损伤所导致的大鼠神经元凋亡，该作用可能与增加Bcl-2/Bax比值、减少促凋亡蛋白Bax的表达和增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关，其抗凋亡作用可能与非磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依赖的蛋白激酶B(Akt)信号转导通路有关。

2.3 Notch信号通路对免疫调节的作用 桑芪首乌方是云南省名中医陆家龙临床应用数十年的经验方，方中制首乌，味苦、甘，性微温，归肝肾经，善补肝肾，益精血；桑寄生味苦、性平，归肝肾经，补肾养血而可益肝肾、强筋骨之功效，偏走于肢体筋脉，可治疗中风病之肢体强急拘挛或筋骨羸弱瘫软诸症；配伍黄芪等以益气活血化瘀，诸药配伍、合用，肝肾得补，精血得旺，髓海得充，瘀去络通，且滋补而不留邪，降泻而不伤正，补中有泻，寓泻于补[24]。黄芪多糖、黄芪甲苷为“桑茂首乌”片中的主要成分[25]。王振纲等[26]研究发现黄芪煎剂能够影响小鼠体内环核苷酸的水平，使小鼠血浆环磷酸腺苷(cAMP)含量增加、环磷酸鸟苷(cGMP)含量减少，可能是黄芪增强小鼠腹腔内巨噬细胞吞噬功能导致。高建峰等[27]在研究黄芪多糖对小鼠脾淋巴细胞内cAMP、cGMP的影响实验中发现，黄芪多糖可抑制cAMP产生，促进cGMP生成，从而降低cAMP/cGMP比例，提示其可能是通过影响脾脏淋巴细胞信号转导而实现免疫调节作用。王文平等[28]研究发现黄芪甲苷可通过NO-cGMP途径增加动脉组织cGMP含量，改善内皮依赖性血管舒张作用。

3 小 结

Notch信号通路在促进胶质再生、维持神经干细胞的增殖中具有重要作用，是脑生发区调节神经干细胞分化和维持平衡的主要分子机制。Notch信号通路上相关分子相互作用，通过Notch通路上其他相关分子抑制神经再生、抑制神经干细胞向神经元及少突胶质细胞分化，是一条信号抑制性转导通路。本研究对近年来中医药治疗缺血性脑卒中作用机制进行总结，得出中成药如健脾益智胶囊、首乌益智胶囊治疗缺血性脑卒中疗效显著，其作用机制与Notch信号通路对神经干细胞的调控作用密切相关。在神经系统中，除Notch通路外的多条信号转导通路参与调控脑缺血后脑内神经干细胞增殖分化进程，各条信号通路通过串话的方式，实现信号通路之间的交流，共同发挥调控作用。

综上所述，中医药治疗缺血性脑卒中与 Notch 信号通路对缺血性脑神经干细胞增殖与分化调控作用相关，从Notch信号通路等与其他信号通路进行研究是今后中医药治疗缺血性脑卒中的研究重点。