中医药防治阿尔茨海默病研究新的切入点——外泌体

陈慧泽，孟胜喜

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病。伴随着各国人口老龄化的加剧，AD的患病率也在逐年攀升，到2050年每33 s就有可能出现1例新的AD病人，但目前尚无针对AD病因的治疗药物[1]。中医药具有多层次、多靶点、多途径、多环节作用和副作用小的特点，在防治AD方面具有独特的优势[2]。不容乐观的是，目前对AD的病因病机、中医证候及治疗等方面的研究仍局限于“还原论”的思维模式，制约了AD的中医药现代研究发展。

外泌体(exosomes)最早于1981年由Trams等在透射电镜下发现，并于1987年被 Johnstone等命名[3]。外泌体的直径在40～100 nm，主要由脂质、蛋白质和遗传物质组成，蛋白质和遗传物质是外泌体发挥生物学功能的有效成分[4]。几乎所有细胞都可以分泌外泌体，外泌体在体液中分布非常广泛，从支气管肺泡灌洗液、血液、尿液、脑脊液、血清和母乳中均发现有外泌体，外泌体的来源不同，其表面分子也迥然不同[5-6]。外泌体在细胞间的信息传递中起重要作用，也参与体内的生理及病理过程[7]。

近年来，外泌体已成为AD发病机制、诊断及治疗的研究热点，也成为AD潜在的病理介质、标志物和治疗靶点[8-9]。外泌体的出现为中医药防治AD提供了良好的切入点，也将会成为AD中医药研究的重要方向。

1 外泌体用于AD的诊断

在临床症状出现前AD的潜伏期较长，目前的治疗措施对AD病情的延缓也难以令人满意。因此，AD的早期诊断及预防尤为重要，发现和筛选早期诊断的AD标志物也更为关键。与中医“治未病”的思想一致。

中医诊治病人一般通过四诊(望、闻、问、切)来进行辨病、辨证。现代医学常常采用视、触、叩、听等诊断方法，生化检测，影像学检查以及蛋白组学、基因组学、代谢组学、转录组学、基因测序等微观途径来分析生命的本质规律。不管在生理还是病理状态下，细胞都可以分泌出相应的外泌体，而后者包含的物质则可以代表细胞或系统一定的生理病理状态。把外泌体的内容物当作一种生物标志物来诊断疾病，与中医辨证论治中微观辨证的理念相吻合。一项进行10年的有关AD早期诊断的病例对照研究提示，定量检测外泌体中磷酸化的Tau蛋白和β淀粉样蛋白(amyliod β-protein，Aβ)有可能在临床症状出现前提前10年诊断AD[10]。作为细胞间通讯的新兴介体，外泌体通过3种方式(自分泌、旁分泌和内分泌)传递生物信息，转移蛋白质、脂质和核酸内容物至靶细胞，调节细胞的生理活动。外泌体研究为微观分子学，但其宏观、整体表达形式的特点非常类似于中医辨证的整体性、变化性。在机体内，细胞不同，其包含的物质也不同，其分泌的外泌体内容物、细胞在不同生理病理状态下也有差异。外泌体具有特异的生物信息，可以介导疾病的进程，因此，是潜在的生物标志物[11]。对外泌体中特异的分子标志物进行检测，将健康与疾病状态下外泌体中物质的差异进行比较，可以很好地应用于疾病的诊断[12]。血液与体液中的外泌体容易分离，也有很好的稳定性，因此常作为检测疾病的标志物。

miRNA是外泌体的重要组成部分，在调节靶细胞中起着非常重要的作用。外泌体中的miRNA比游离miRNA更适合作为标志物。不同细胞源性外泌体可以带有具有自身特性的miRNA[13]。在AD的病理和生理过程中，多种细胞源性外泌体可以通过miRNA进行参与[14]。

AD病人体内的外泌体中不同种类RNA的改变也使其成为AD新型诊断标志物。Lugli等[15]比较AD病人与健康个体血浆外泌体中miRNA，发现这两者具有差异，miRNA-193b是淀粉样前质蛋白(APP)基因的调节因子，脑脊液中提取的外泌体所含miRNA-193b的数量改变，使AD的早期诊断成为可能[16]。

外泌体作为介质，促进细胞间通讯，并通过将其内容物传递给靶细胞来重新编程受体细胞，目前传统提取基因组需要骨髓活检，但是人们可以轻松从外周血中获得外泌体，因而外泌体可以作为无创生物标志物的优先候选物。

2 外泌体用于AD的中医证候规范化

中医药治疗AD具有一定优势和特点，但也存在一些不足，如中医药辨证及疗效评价标准尚不统一，辨证分型也比较复杂[17]。中医证候是辨证论治的基础，也是中医理论体系的重要内容，研究中医证候是中医药现代化的关键部分。中医证候是一个动态变化的过程，具有多变性、复杂性、模糊性、隐匿性等特点。因此，如何将中医证候规范化势必将成为中医药现代化发展的方向。

外泌体具有稳定性、广泛性、特异性、靶向性、运输性、通讯性、透膜性、免疫原性等特点，与中医证候的恒动观、整体观、辨证论治思维极度相似，又能巧妙地应对AD中医证候的多变性、复杂性、模糊性、隐匿性等特点，对揭示AD的证候本质有巨大优势[18-22]。

在AD的中医证候研究中引入外泌体，将拓展和加深对AD中医证候的认识，有可能揭示中医辨证论治AD的本质。在中医辨证的基础上，获得组织或血清标本，观察和分析其与对照基因表达谱的不同，能够从整体上分析外泌体在不同证型中的表现，从而归纳总结出AD中医证型的本质规律。中医药对AD的作用主要在于异常基因的表达调控，因此，外泌体有可能成为直接或间接作用的靶标。

外泌体作为脏腑相关的物质基础，可以沟通两者间的信息[23]。将外泌体引入中医证候机制的研究中，以微观辨证的思维作为桥梁，分析外泌体在中医证候发生过程中的变化，将对中医证候微观辨证的现代生物机制研究非常有益。

3 外泌体用于AD的治疗

中医药在治疗AD方面具有独特的作用和优势。传统中医药虽有完整的理论体系和良好的临床疗效，但其制剂多局限于汤剂、丸剂及散剂等，缺点是有效成分溶解度低、生物利用度不高、疗程长、效果较慢等[24]。因此，寻找科学、有效、现代化的给药方式，将是今后中医药治疗AD的重要途径。外泌体作为一种天然、新型药物传递系统的载体，在AD的诊治及预后中均可以发挥重要的作用。

外泌体作为药物载体具有免疫原性低、固有稳定性好、传递效率高、能透过血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)等优点。因此，外泌体作为药物递送载体具有独特的天然优势。近年来，有关外泌体递送药物的研究逐渐增多，外泌体的来源不同，其靶向性也不同，一些小分子的化学药物及基因药物等已经被成功载入外泌体，在AD的治疗中将发挥出巨大的潜能[25]。Alvarez-erviti等[26]首次利用骨髓源树突状细胞作为外泌体的来源运送siRNA，透过血脑屏障达到中枢神经系统，从而证实了外泌体作为药物载体的可行性。在给小鼠喂食药用植物金银花后，在小鼠的血清和尿液中可以检测到金银花miRNA[27]。在给小鼠喂食中药汤剂，然后全面分析进入小鼠组织中的中药miRNA，可以在其肺组织中发现大量来自中药的miRNA，经过对来自NCBI GEO数据库的健康人体组织miRNAseq原始数据样本和半枝莲、柴胡、穿心莲、紫花地丁、黄芩等10种中药的miRNA数据库miRBase进行筛选鉴定，证实“中药miRNA能够跨界转运”[28]。

有学者用巨噬细胞外泌体携带姜黄素来改善AD症状也取得了一定成功，较好地改善了AD小鼠的认知和学习能力[29]。Qi等[30]利用血浆外泌体携带槲皮素(Exo-Que)提高了槲皮素(Que)的脑靶向性和生物利用度，与游离Que相比，Exo-Que通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)介导的Tau蛋白磷酸化和减少不溶性神经原纤维缠结(NFTs)的形成，较好地缓解了AD的症状，提示其具有治疗AD的作用。

另外，脑微血管内皮细胞衍生的外泌体可以通过上调AD小鼠模型中P-糖蛋白(P-gp)，增强清除Aβ，从而有效改善其认知功能障碍[31]。外泌体生物标志物对神经退行性疾病的临床前诊断和临床试验中治疗反应的评估也发挥了重要作用[32]。

本课题组选择2018年1月—2019年1月上海交通大学附属第六人民医院收治的52例AD病人作为研究对象，采集其空腹静脉血制备血清标本。以Exo Quick试剂盒提取外泌体，并以铀铅双染色法处理后的组织块置于电镜下鉴定，结果发现，52例AD病人血清外泌体的直径为(96.25±22.18)nm。因此，验证了AD病人的血清中的确含有外泌体。

本课题组遵循中医理论，经过长期临床探索，总结出治疗AD疗效明确的中药复方恒清Ⅱ号方(专利号：ZL201910371018.5)[33-35]。前期通过动物实验发现，与3月龄C57BL/6J小鼠(即对照组)比较，同月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠(即模型组)不仅海马组织中的 miRNA-29c水平明显下降，而且模型组小鼠的脑脊液和外周血外泌体中的miRNA-29c水平也明显下降(P<0.01)；经过恒清Ⅱ号方干预8周的AD模型小鼠(即治疗组)海马组织中的 miRNA-29c水平高于模型组小鼠，治疗组小鼠的脑脊液和外周血外泌体中的miRNA-29c水平也高于模型组小鼠，差异均有统计学意义(P<0.05)。本课题组的研究表明外泌体内miRNA-29c将有可能成为AD诊断的生物标志物。中药复方恒清Ⅱ号方可能通过上调AD小鼠海马组织中的miRNA-29c水平及其脑脊液和外周血外泌体中的miRNA-29c水平，从而改善APP/PS1双转基因AD小鼠的认知功能。

4 小 结

外泌体共有的细胞蛋白质决定了外泌体的标志性存在，而其不同来源特有的成分又决定了外泌体功能的各异性。对来源不同的外泌体携带的内容物进行研究，筛选出特异的分子标志物，将为AD的诊断与治疗提供新的方法。随着精准医学、纳米技术、组学技术、网络药理学等的飞速发展，中药自身具有多途径、多靶点等作用特点，对中药有效成分的分离提纯后将药物通过适宜的方法导入外泌体，有望实现中药的靶向用药及对靶器官的精准干预[36-39]。

中医药防治AD的现代研究极需特异性的指标评价。不管是中药单味药还是中药复方，均为多靶点、多途径参与AD治疗。外泌体源性miRNA具有高度特异性，外泌体作为载体，携带miRNA及蛋白质，参与细胞通讯。因此，通过外泌体途径研究AD病理生理过程、中医辨证内涵、疗效评价机制等将具有重要的医学意义。且中医理论的物质基础与外泌体之间存在关联性，中医理论能为外泌体研究AD提供明确的指向性[40]。因此，外泌体不仅为今后研究AD发生发展规律、证候规范化、中药载体、治疗方法及药物等提供新的切入点，而且也为中医药现代化发展提供了新思维和新思路。