核因子E2相关因子2在脑缺血再灌注损伤中的研究进展

韩玉迪， 白 波， 王美琴， 朱 帆综述， 李东芳审校

缺血性卒中是全球致死和残疾的主要疾病之一，发病率逐年上升，严重危害人类健康，在时间窗内实现血管再通及组织再灌注是治疗重点，有效的治疗方法包括静脉溶栓、机械取栓等[1]，然而再灌注后发生脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)可导致患者产生更为严重的神经损伤和功能缺损。在CIRI发生过程中，活性氧大量产生且清除不足，氧化和抗氧化作用失衡造成细胞、组织氧化损伤，氧化应激是CIRI的关键环节。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是调控内源性抗氧化应激的重要转录因子，研究表明其介导的信号通路可通过抗氧化应激、抗炎、调节线粒体分裂和细胞凋亡、保护血脑屏障等多个途径减轻脑缺血再灌注损伤，可作为治疗缺血性卒中的新策略。现将Nrf2基本结构、调控机制及其在脑缺血再灌注损伤中作用的研究进展整理如下。

1 Nrf2的基本结构

Nrf2是具有高度保守的碱性亮氨酸结构bZip的对氧化应激敏感的转录因子，包含7个功能结构域(Neh1-Neh7)来调节其转录活性和稳定性。Neh1含有bZip序列，可与核内的小Maf蛋白形成异二聚体，使Nrf2能识别并结合抗氧化反应原件(antioxident response element,ARE)以启动目的基因的表达,Neh1还可以与E2泛素结合酶相互作用以调节Nrf2的稳定性。Neh2含有DLG和ETGE两个结合位点，可与Kelch样环氧化氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)区域结合，促进Nrf2降解，负性调控Nrf2 的转录活性。Neh3位于Nrf2的C端，与细胞转录活性密切相关。Neh4和Neh5通过与转录共激活因子结合，在促进Nrf2转录中发挥协同作用，并且还通过与核辅因子RAC3/AIB1/SRC-3结合，增加Nrf2-ARE基因表达[2]。Neh6和Neh7调控Nrf2的非Keap1依赖性降解，并调节Nrf2的活性，β-转录重复包含蛋白1(β-TrCP1)介导的对Nrf2的降解依赖于对Neh6的识别[3],Neh7可特异性地与维甲酸X受体α(RXRα)相互作用来抑制Nrf2表达。

2 Nrf2的调控机制

Keap1是Nrf2的负性调节蛋白，正常情况下锚定在胞浆肌动蛋白细胞骨架上[4]，由CTR、NTR、BTB、IVR及DGR 5个结构域构成。BTB区，负责同源二聚化Cullin3(Clu3)，是Keap1与Cul3作用的区域，可介导Nrf2的泛素化及降解。IVR区含有大量半胱氨酸残基，对亲电试剂和氧化剂敏感，是Keap1蛋白的重要功能调节区域。DGR区又称Kelch区，既是Keap1与Nrf2的Neh2区的结合位点，也是Keap1与胞浆肌动蛋白的结合位点。

在正常生理条件下，非活性Nrf2与Keap1-Cul3-Rbx1复合物结合被限制在细胞质中，这促进了Nrf2的泛素化和蛋白酶体降解，使其保持最低表达量，以维持动态平衡[2]。氧化应激时，在ROS作用下，Keap1半胱氨酸残基氧化，构象发生改变，Keap1介导的Nrf2降解减少，Nrf2与之解离。还有一种门闩和枢纽学说，基础条件下，Nrf2的DLG区和ETGE区均与Keap1的DGR区相结合，介导Nrf2的泛素化。当氧化应激时，结合力弱的DLG区从DGR区解离下来，但高亲和力的ETGE区仍然结合与DGR区，占据了Keap1的位点却不能使Nrf2降解，新生成的Nrf2因Keap1的结合位点饱和而不能与之结合，使Nrf2含量升高。Nrf2转移至细胞核内与核内小Maf蛋白结合形成异二聚体，与ARE结合促进下游基因的转录及多种抗氧化酶及Ⅱ类解毒酶等的生成。

此外，Nrf2的激活还受到其他因素的调节。各种蛋白激酶对Nrf2的磷酸化也能影响Nrf2的活化。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导和细胞外调节激酶(ERK)参与了Nrf2转位，上调PI3K、Akt或ERK减弱均可激活Nrf2[5,6]。蛋白激酶C(PKC)对Nrf2 Ser40磷酸化促进了Nrf2与Keap1的解离[7]。自噬相关蛋白p62也可参与Nrf2的调节，p62作为一种选择性自噬底物，正常情况下经自噬降解；氧化应激时p62上调可依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)与Keap1上的Nrf2结合位点相互作用，以实现Nrf2的稳定和激活[8,9]。此外，糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、β-TrCP、CpG甲基化、组蛋白磷酸化和乙酰化也调节了Nrf2的表达和活化[3,10～13]。

3 Nrf2在脑缺血再灌注中的作用

许多研究表明，在卒中急性期，Nrf2的表达显著增加，且梗死周围区较中心区水平更高[14]，可能是由于梗死周围区的氧化应激高于核心区所致[15]。卒中后不同类型的细胞包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和中性粒细胞等，均会表达Nrf2，表达情况可能受时间影响。在再灌注8 h的梗死周围区中，Nrf2在神经元中表达，而在星形胶质细胞或小胶质细胞中不表达[15]，在再灌注的24 h的梗死周围区，Nrf2在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中均有表达。以上均表明Nrf2信号通路对脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)做出了应答。

与野生型小鼠相比，Nrf2基因敲除鼠进行短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)造模后抗氧化酶、解毒酶的基础活性和诱导活性均降低，梗死面积更大，行为学表现也更差[16]，更容易遭受缺血性脑损伤和神经系统损害。可见Nrf2在CIRI中起着颇为重要的作用。

3.1 抗氧化应激作用 由于脑组织需氧程度高且含有丰富的易被氧化的不饱和脂肪酸，抗过氧化能力及清除自由基的能力明显低于其他组织[17]，脑I/R时大量自由基的生成诱发氧化应激，对脑组织造成损伤。Shah等人研究表明神经元中的Nrf2激活可由氧化应激诱导，激活了一系列抗氧化基因的转录[18]。已经证实脑I/R后Nrf2表达增高，诱导多种内源性抗氧化酶的产生，如醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素加氧酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，从而减少或清除氧自由基，提高细胞、组织抗氧化能力[19]。给予Nrf2激活剂后脑组织内Nrf2及HO-1、NQO-1表达增多，SODs、CATs、GSH-Px和GSH活性升高，ROS活性及MDA含量减少，敲除Nrf2后上述保护作用被抑制，可证明激活Nrf2信号通路可通过抗氧化应激减轻CIRI[20]。

3.2 减轻炎症反应 脑I/R后炎性细胞因子的过度释放以及随后的继发性炎症反应是脑损伤恶化发展的主要原因之一。Nrf2能负调节NF-κB(许多促炎基因的主要调控因子)信号通路，Nrf2基因敲除鼠的Toll样受体4(Toll like receptor-4,TLR-4)和NF-κB的表达要高于受tMCAO作用的野生型小鼠，有更严重的神经功能缺损、梗死面积及炎性损害[21]。此外Nrf2调节的下游信号蛋白HO-1能将促炎游离血红素催化分解生成等摩尔数的铁以及抗炎化合物CO和胆红素[22]，发挥抗炎作用。NOD样受体蛋白-3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体在缺血诱导炎症损伤中扮演着重要角色，硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)与NLRP3的激活密切相关，TNNIP在氧化应激下从硫氧还蛋白1(Trx1)/TXNIP复合物中解离出来[23]。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)上调Nrf2显著降低了tMCAO后TXNIP、NLRP3炎症小体以及下游因子caspase-1、IL-1β and IL-18的表达[23]，增强血管生成和星形胶质细胞激活降低CIRI[24]。此外，激活Nrf2抑制了tMCAO后7 d内急性胶质细胞活化，7～14 d内发挥免疫调节作用，将梗死区中性粒细胞和T细胞的浸润以及激活的小胶质细胞/巨噬细胞的数量减少50%以上[25]。

3.3 调节线粒体分裂和细胞凋亡 线粒体融合和分裂的平衡在维持神经元的正常功能中起着至关重要的作用，CIRI可以通过调节融合和分裂相关蛋白的表达和翻译后修饰来破坏线粒体融合和分裂的平衡，从而破坏细胞内环境的稳态，导致神经元死亡[26]。线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1在线粒体分裂和融合中起重要作用,Drp1是线粒体分裂的执行蛋白，在细胞受刺激时被Fis1招募至线粒体外膜的特定位点持续收缩而分割线粒体,可以调节线粒体的数量、细胞能量的变化和及时处理受损的线粒体,线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1表达可以作为线粒体结构是否稳定的指标；促凋亡蛋白Bax与Drp1可共定位于分裂点上，Bax寡聚化形成孔道促进细胞色素C释放和细胞凋亡，加剧神经元的损伤[27]。在脑I/R模型中，当Nrf2核蛋白被抑制之后，线粒体分裂相关蛋白指标明显升高，线粒体形态损伤加重，凋亡率增高[27]。因此Nrf2介导的信号通路在脑I/R中作为内源性保护通路，抑制线粒体分裂，减少细胞凋亡，减轻脑损伤。

3.4 保护血脑屏障 血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)的结构及功能正常是维持中枢神经系统内环境稳定的关键。脑I/R可以造成血脑屏障完整性破坏、通透性增加，进一步加重缺血脑组织的损伤[28]。Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)可在体内实验阻止内皮间紧密连接的破坏和缝隙形成，降低脑组织中的基质金属蛋白酶活性，体外实验维持内皮紧密连接，抑制炎性细胞因子表达，并减弱白细胞迁移，而Nrf2敲除加重了缺血状态下紧密连接蛋白ZO-1离域并减弱了DMF的保护作用，表明了Nrf2在BBB完整性中的保护作用[29]，其他Nrf2激活剂，如萝卜硫素(SFN)，也表现出了对血脑屏障的保护作用[30]。

4 小 结

Nrf2作为内源性抗氧化防御的关键成分，在体、离体实验均证明激活Nrf2途径的治疗有利于减轻CIRI，涉及的机制包括抗氧化应激、抗炎、调节线粒体功能、抗凋亡、保护血脑屏障等，可减小梗死面积、减轻神经功能缺损，是缺血性卒中的高价值治疗靶点。目前有越来越多的药物表明可通过Nrf2途径减少CIRI，但具体Nrf2的激活途径、减轻CIRI的具体机制仍不明确，亟需我们进行进一步研究。总而言之，靶向Nrf2的卒中治疗是一个很有希望的领域，但目前仍处于研究的初始阶段，未来还需要进一步的讨论和研究。