不同培养条件对栗仁菌核青霉菌生长的影响

霍佳欢 李双民 温晓蕾 冯丽娜 李雅丽 张娜娜 兰淑慧 齐慧霞

摘要：菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）是板栗储藏期引起栗仁腐烂的主要致病菌之一。为明确该病菌生长及产孢的适宜环境条件，本试验采用生长速率法和血球计数法对不同营养、温度、pH值、通气状况等条件下病菌的生长情况进行了研究。结果表明，最适宜栗仁菌核青霉菌菌丝生长和产孢的温度为25 ℃，pH值为6，光照条件为全黑暗;沙堡弱培养基最适合该病菌菌丝生长，燕麦马铃薯培养基最适合产孢;菌核青霉菌在以木糖醇为基础碳源的培养基上菌落直径最大、产孢量最多;菌丝生长的最佳氮源为牛肉膏，产孢量最多的氮源为蛋白胨和酵母浸粉;菌丝体在24 h连续振荡的条件下生长的最好;50 ℃为菌核青霉菌致死温度。

关键词：板栗;栗仁腐烂病;菌核青霉菌;培养条件

中图分类号： S436.64  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）23-0129-04

收稿日期：2021-03-25

基金项目：国家重点研发计划（编号：2020YFD1000700）;河北省教育厅平台项目（河北省板栗产业协同创新中心，2019—2023年）。

作者简介：霍佳欢（1997—），女，河北廊坊人，硕士研究生，研究方向为板栗病害流行与防控，E-mail：2469634717@qq.com;共同第一作者：李双民（1968—），男，河北昌黎人，中学高级教师，研究方向为果树病虫害防治，E-mail：lishuangmin2021@163.com。

通信作者：温晓蕾，硕士，实验师，研究方向为分子植物病理学，E-mail：xiaoleiwen@sina.com;齐慧霞，硕士，教授，研究方向为植物病害流行与防控，E-mail：qihuix@163.com。

栗仁腐烂病是板栗生产上的常见病害之一，在南北方各板栗产区均有发生，近年来因板栗产量的大幅度提高，栗仁腐烂率也随之增加，危害率高达40%～50%，严重制约着板栗产业的发展[1-2]。栗仁腐烂病常发生于贮藏期间，多由病原微生物引起，常见的有镰刀菌属、链格菌属、单端孢属、青霉属以及曲霉属等[3]，其中青霉属在全国各板栗产区均可危害，造成栗仁发生青腐，产生褐色或青色的病斑，后期转为蓝绿色或青绿色[4]。目前板栗上已报道的青霉种类有小刺青霉、扩展青霉以及拟青霉等[5-7]，而对菌核青霉的研究相对较少。本试验对引起贮藏期栗仁腐烂的菌核青霉菌其适宜培养条件进行研究，以期为制定有效的防腐保鲜措施提供科学依据，减少不必要的经济损失。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019—2020年在河北科技师范学院植物保护实验室开展。栗仁菌核青霉菌（Penicillium sclerotiorum）由河北科技师范学院植物保护实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 在无菌超净台内，将直径5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼分别接种到玉米粉、胡萝卜、番茄、沙堡弱、燕麦马铃薯、绿豆、肉汁胨、板栗培养基平板中央，每种培养基各设3个重复，均于25 ℃全黑暗条件下培养。每间隔24 h采用十字交叉法[8]测量菌落直径，菌落生长14 d时采用血球计数法测定孢子数量[9]。

1.2.2 温度对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 超净台内将直径为5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼接种于马铃薯葡萄球琼脂（PDA）培养基中央，分别放置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗培养箱中培养，每个温度均设3次重复，菌落直径和产孢量的测量方法同“1.2.1”节。

1.2.3 光照对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 超净台内将直径为5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼接种于PDA平板中央，设置不同光照（24 h光照、12 h 光照/黑暗、24 h黑暗）条件，25 ℃下培养，每个处理重复3次。菌落直径和产孢量的测量方法同“1.2.1”节。

1.2.4 不同pH值对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液调节PDA培养基的pH值，制成pH值为5、6、7、8、9、10、11的7种不同培养基，将直径为5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼接种于PDA平板中央，在25 ℃全黑暗条件下进行培养，每种pH值设3次重复，菌落直径和产孢量的测量方法同“1.2.1”节。

1.2.5 碳源对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 将察氏培养基作为基础培养基，分别用等量的肌醇、可溶性淀粉、葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖醇和乳糖替换察氏培养基中的蔗糖[10]，将直径为5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼接种于平板中央，每种碳源设3个重复，25 ℃全黑暗条件下培养。菌落直径和产孢量的测量方法同“1.2.1”节。

1.2.6 氮源对菌核青霉菌菌丝生长和产孢的影响 基础培养基同上，以等量的牛肉膏、硫酸铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母浸粉和氯化铵替换察氏培养基中硝酸钠[10]，将直径为5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼接种于平板中央，每个处理重复3次，25 ℃黑暗下培养。菌落直径和产孢量的测量方法同“1.2.1”节。

1.2.7 通气状况对菌丝生长的影响 将液体PDA培养基分装到三角瓶中，每瓶100 mL，将3个直径为0.5 mm的栗仁菌核青霉菌菌饼在超净台内接种到三角瓶内，在温度为25 ℃，转速为120 r/min摇床内分别24 h振荡、12 h振荡/12 h静止、24 h静止培养 5 d，每个处理设3次重复。5 d以后，将菌丝通过纱布过滤，用烘箱烘干（直到不含有任何水分），称量菌丝干质量[11]。

1.2.8 致死温度的测定 菌核青霉菌生长初期，未產孢之前（2 d以内）转入装有5 mL无菌水的试管中，每个处理标好编号，设置3个重复，将各试管按照不同编号依次放入40、45、50、55、60、65 ℃水浴锅中，水浴10 min，然后将处理后的菌饼接种到PDA培养平板中央。25 ℃培养48 h后观察菌丝生长情况，明确致死温度。

2 结果与分析

2.1 培养基对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

由表1可知，栗仁菌核青霉菌在8种培养基上均可生长，最适合菌核青霉菌生长的培养基为沙堡弱培养基，14 d菌落直径达7.95 cm;其次为板栗培养基，菌落直径可达6.98 cm。适宜菌核青霉菌产孢的培养基为燕麦马铃薯培养基，培养14 d产孢量可达6.99×105个/皿。表明沙堡弱培养基最适合菌丝生长，燕麦马铃薯培养基最适合产孢。

2.2 温度对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

由表2可知，温度对病原菌菌丝生长和产孢量均有显著影响，栗仁菌核青霉菌在10～30 ℃条件下均能生长，最佳的生长温度范围在20～30 ℃，其中在25 ℃条件下菌落生长最好，14 d时菌落直径可达到6.33 cm;同时25 ℃也最适合产孢，14 d时产孢量为3.76×105个/皿。温度低于5 ℃或高于35 ℃时菌落生长十分缓慢，略有菌丝产生。

2.3 光照对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

由表3可知，在3种不同光照条件下，栗仁菌核青霉菌以全黑暗条件下生长最快，14 d时菌落直径达6.8 cm。24 h光照和12 h光照/黑暗条件下菌落直径相对较小，分别为6.02 cm和5.83 cm，且这2处理对菌核青霉菌菌丝生长的影响无显著差异。全黑暗、全光照和12 h光照/黑暗3个处理对菌核青霉菌产孢量影响无显著差异，14 d时产孢量分别为3.95×105、3.63×105、3.73×105个/皿。表明菌核青霉菌在黑暗条件下更易于菌丝生长和产孢。

2.4 不同pH值对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

栗仁菌核青霉菌在7种不同pH值上生長状态如表4所示，最适宜栗仁菌核青霉菌菌丝生长和产孢的pH值为6，培养14 d菌落直径达6.62 cm;产孢量为3.70×105个/皿。pH值为11时，菌落生长较慢，培养 14 d 菌落直径为5.93 cm;pH值为5时，不适宜其产孢，培养14 d产孢量为2.35×105个/皿。

2.5 碳源对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

由表5可知，菌核青霉菌在8种不同碳源上均能生长，菌丝在以木糖醇为碳源的培养基上生长的最好，菌落直径最大、产孢量最多，培养14 d菌落直径为6.02 cm，产孢量为4.27×105个/皿;菌丝对可溶性淀粉的利用能力最低，培养14 d菌落直径仅为3.45 cm。

2.6 氮源对菌核青霉菌菌丝生长、产孢的影响

由表6可知，栗仁菌核青霉菌在以牛肉膏、蛋白胨和硫酸铵为基础氮源的培养基上生长的好，其中以牛肉膏的利用率最高，14 d时的菌落直径为 7.68 cm;该病菌在以酵母浸粉和硝酸钠为基础氮源的培养基上菌落扩展相对较慢。供试氮源培养基中以蛋白胨和酵母浸粉的产孢数量大，14 d时产孢量分别为4.79×105、4.80×105个/皿，二者之间无显著差异。

2.7 通气状况对菌核青霉菌生长的影响

由图1可知，菌核青霉菌在不同通气状况下菌丝生长有较为显著的差异，该病菌在24 h振荡条件下菌丝生长的最好，培养5 d菌丝干质量可达 0.40 g;在24 h静止和12 h振荡/12 h静止下该病菌菌丝生长相对较慢，5 d时菌丝干质量分别为0.21 g和0.16 g，由此可见菌核青霉菌在通气良好的条件下更适宜生长。

2.8 致死温度测定结果

将栗仁菌核青霉菌菌饼分别在40、45、50、55、60、65 ℃不同温度的水浴锅中处理10 min后，转移到PDA平板中央25 ℃培养48 h，结果（图2）表明，在40 ℃和45 ℃条件下处理的菌丝均可继续生长，在50、55、60、65 ℃条件下处理过的菌丝则停止生长。因此可确定栗仁菌核青霉菌菌丝的致死温度为50 ℃。

3 结论与讨论

本试验结合菌丝生长量和产孢量2个标准来衡量菌核青霉菌的适宜培养条件。研究发现，沙堡弱培养基最适合菌核青霉菌菌丝生长，燕麦马铃薯培养基最适合产孢;最适宜菌丝生长和产孢的温度为25 ℃，pH值为6，光照条件为全黑暗;栗仁菌核青霉菌对木糖醇的利用率最高，在以木糖醇为基础碳源的培养基上菌丝最适宜生长、产孢量最大;氮源中最适宜菌丝生长的为牛肉膏，但最适宜产孢的为酵母浸粉和蛋白胨;在24 h连续振荡培养条件下最适合菌丝生长，培养5 d后菌落干质量达0.40 g。

郜海燕等指出，最适合扩展青霉生长的pH值为8，最适宜菌丝生长的碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母浸粉，这与菌核青霉略有不同[12]。王俊凤等认为小刺青霉菌最适宜的生长温度为20 ℃，pH值为7，最适宜菌丝生长和产孢的碳源分别为可溶性淀粉和甘露醇;同时适宜菌丝生长和产孢的氮源为酵母浸粉[5]。菌核青霉菌和小刺青霉菌虽同为青霉属，且均为腐烂病的致病菌，但二者适宜生长条件具有一定差异，可能因病菌生长环境和种间差异所引起。丁仁惠等研究发现指状青霉和意大利青霉的致死温度分别为80 ℃和75 ℃，与菌核青霉的致死温度50 ℃略有不同，此差异可能是因生长环境不同或因寄主不同所导致[13]。本研究明确了栗仁菌核青霉菌对环境和营养条件的需求，为有效预防和防治由菌核青霉菌引起的栗仁腐烂病提供理论支撑，具体防腐方法还需进一步研究探讨。

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