动脉粥样硬化实验室模型研究进展

窦曼曼，宋晓南，陈 盈综述，邢英琦审校

心脑血管疾病在人群中的发病率越来越高，而动脉粥样硬化是血管疾病发生的重要发病基础[1]，所以研究其发病机制及其影响因素就显得尤为重要[2]。对于科研工作者来说，成功建立动脉粥样硬化模型是实验开始的基础。动脉粥样硬化的模型主要包括动物模型和细胞模型[3]。动物模型主要使用老鼠、兔子、狗、猪和非人灵长类动物如猴子等造模。细胞模型主要使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、淋巴细胞等造模，模拟动脉硬化形成的过程。本文针对这两类模型目前的研究进展进行阐述。

1 动脉粥样硬化的动物模型

1.1 兔子 兔子由于对胆固醇饮食敏感，高脂喂养后可以快速形成动脉粥样硬化斑块，而且在实验中易操作，所以在动脉粥样硬化模型中是一个比较成熟的模型动物[4]。在兔子的动脉粥样硬化模型中，新西兰大白兔是最常用的一个物种。选择兔子作为动脉粥样硬化模型时需要考虑的因素主要有：(1)在兔子动脉粥样硬化模型中，由于其仅能形成早期脂质条纹，不能形成纤维斑块，这与人体内可形成的纤维斑块有一定差异；(2)其肝脂肪酶活性低，容易形成肝脂肪沉积，导致肝损伤[5]；(3)动脉粥样硬化形成的周期较长，兔子在该造模周期中可能会发生不可控的情况；(4)兔子和人生理结构还是有一定的解剖差异，以至于用兔子作为动脉粥样硬化模型研究出来的结论可能在人身上并不适用，所以选择兔子造模的时候也要考虑到这一点[6]。用兔子制造动脉粥样硬化模型有很多方法，包括高脂饲料喂养法、炎症免疫法、内皮损伤法、基因工程法等[7]。现在就几种常用的造模方式进行介绍。

1.1.1 内皮损伤法造模 在上述各种方法中，高脂喂养造成的动物高脂血症是引起动脉粥样硬化的基础，各种方法导致内膜损伤，加快了动脉粥样硬化的形成，节省了造模所需要的时间，由此建立的模型病变过程与人类动脉粥样硬化的演变过程相似，所以是目前实验中常用到的造模方式。内皮损伤的方法主要包括神经损伤、内皮干燥、球囊损伤等。现在研究中我们常使用高脂喂养联合球囊损伤的方法，该方法可以制备很成熟的动脉粥样硬化模型，现将该方法的技术操作要点介绍如下。

球囊损伤法：术前12 h禁食，不禁水。称体重，给予25%乌拉坦注射液(4g/kg)耳缘静脉注射，麻醉成功标志：呼吸深慢均匀，四肢瘫软，角膜反射迟钝。麻醉成功后耳缘静脉推注肝素钠200 IU/kg，防止凝血。动物仰卧位固定于无菌手术台，电推剪脱毛，常规外科消毒，铺巾，沿颈正中线切开颈部皮肤，暴露皮下组织，纵行逐层钝性分离肌肉、筋膜，分离颈动脉血管，保护伴行的神经，区分颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉后，应用动脉夹结扎颈总动脉和颈内动脉，眼科剪斜向颈外动脉剪一“V”型小口，将2.5 mm×15 mm球囊经颈外动脉送入颈总动脉至主动脉弓处，给予合适压力，重复操作3-4次，随后抽空球囊，缓慢撤出导管，无菌缝合线结扎颈外动脉，撤出动脉夹恢复血流。检查有无出血、渗血，逐层缝合肌肉、皮质。应用800000 IU青霉素肌肉注射3 d预防感染。假手术组仅在解剖出颈总动脉后，用无菌缝合线在颈外动脉(远心端处)打一死结，不进行球囊损伤，青霉素肌肉注射3 d预防感染[8，9]。

球囊损伤法除了损伤颈动脉外，球囊拉伤腹主动脉后并高脂喂养也是常用的方法之一[10]。10%水合氯醛腹腔注射(5 ml/kg)麻醉后，钝性分离出右股动脉，注意保护股神经，损伤后容易出现术肢瘫痪。将球囊导管(大小：2.75 mm×15 mm)套进PTCA导丝(0.014)，导丝与球囊头端并齐，连接压力泵，插入前球囊表面用肝素盐水湿润减少阻力，抽负压使其变硬，眼科剪在股动脉剪一小口，将球囊插入股动脉内，随后先推送导丝约20 cm，固定导丝，沿导丝送入球囊导管约15 cm，6～8个标准大气压充盈球囊，下拉球囊至阻力明显增大处即可停止，根据阻力大小可调整压力泵数值，然后压力泵恢复负压，重新送入球囊，如此反复3次。术后结扎，逐层逢合伤口[11]。术后肌肉注射青霉素30万单位防治感染，连续3 d[12]。

1.1.2 基因工程法造模 低密度胆固醇(LDL)在血管内皮聚集并激活一系列炎症反应引发动脉粥样硬化，LDL在动脉粥样硬化发生发展过程中起着关键性的始动作用。当低密度胆固醇受体(LDLR)缺失时会引起体内脂质代谢障碍，造成脂质聚集，易形成动脉粥样硬化。所以LDLR-/-兔子高脂喂养后易形成动脉粥样硬化，可作为动脉粥样硬化模型的造模动物[13]。

1.2 小鼠 鼠因为它快速繁殖，易于操作以及在合理的时间内形成血管硬化并易于监测，已经成为主要的物种来研究实验性动脉粥样硬化，[14]。载脂蛋白E(ApoE)是一种有明显基因多态性的多功能蛋白，与脂蛋白的代谢有密切联系，其缺失和变异都会引起体内代谢失常及功能紊乱，甚至引起一系列疾病和并发症。小鼠由于在病理及组织学形态上与人类极其相近，高脂膳食喂养的小鼠是研究动脉粥样硬化的常用动物模型之一[15]。在具体喂养方法上，对于普通小鼠，通常给予普通饲料喂养。对于ApoE-/-小鼠给予西方饮食(21%脂肪+0.15%胆固醇)喂养12 w后，其血脂水平显著增高，在主动脉根部位置，管壁有增厚，斑块也有明显增多，表现出典型的动脉粥样硬化病理特征。给予ApoE-/-小鼠高脂饲料(含18%氢化可可脂、0.15%胆固醇、7%酪蛋白、7%蔗糖和3%麦芽糊精)喂养8 w后，通过对小鼠心脏主动脉瓣行苏木精-伊红(HE)染色，证实动脉粥样硬化模型制备成功[16]。高脂喂养后的apoE-/-雄鼠可在多个血管部位形成动脉粥样硬化斑块，尤其是主动脉根部，腹主动脉[17]。目前apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化模型已经广泛用于实验[18]。apoE-/-小鼠也有一定的局限性。首先，脂质代谢不同，小鼠血浆中的胆固醇大部分是VLDL，而不是人体内观察到的LDL。其次，ApoE由于其抗氧化、抗增殖和抗炎作用，被发现除了介导脂蛋白清除外，还可能具有额外的动脉粥样硬化保护特性。这些问题都限制了apoE-/-小鼠用于实验研究[19]。

另外，转基因小鼠除了apoE-/-小鼠广泛用于实验中外，LDLR-/-小鼠也被用于动脉粥样硬化实验的模型。LDLR是肝细胞中的细胞表面受体，介导apoE的内吞作用，清除循环中胆固醇含量丰富的LDL颗粒，与野生型相比，LDLR-/-小鼠血浆总胆固醇水平增加了2倍[20]。LDLR缺失影响脂蛋白的代谢，由此建立起来的动脉粥样硬化模型可以更大的归因于脂代谢异常，在实验研究中模型更稳定。

1.3 大鼠 大鼠作为模型动物也常被用于动脉粥样硬化实验。由于大鼠无胆囊的生理结构特点，造成大鼠对胆固醇等脂质吸收较少，单纯的高脂饲料喂养只能造成大鼠体内脂质沉积，很难形成典型的动脉粥样硬化。而高脂饮食造模时间较长[21]，高脂饮食有肝脏毒性，会使动物消瘦，造模期间有可能发生继发感染，从而影响实验的稳定性[22]。维生素D可以加快大鼠体内血钙吸收，造成内膜损伤，所以高脂饲料结合维生素D能导致动脉粥样硬化，一般采用维生素D3或D2。高脂饲料加定期注射维生素D3(6×105IU·kg-1)后8 w能加快形成动脉粥样硬化[23]。高脂饲料结合维生素D的同时，加以手术机械损伤作用可形成与人类动脉粥样硬化相似的较成熟的病变斑块。机械损伤法主要包括球囊损伤法、电击损伤法和动脉钳夹法[24]。载脂蛋白E(apoE)参与脂蛋白代谢，在大鼠的脂质代谢中发挥着重要作用，故与小鼠类似，apoE-/-雄鼠高脂喂养后也能较快地形成动脉粥样硬化[25]。LDLR-/-鼠或apoE-/-和LDLR-/-双敲除(KO)鼠也被用于动脉粥样硬化中，基因敲除后的大鼠可以引起体内高脂血症，这对形成动脉粥样硬化极其重要。大鼠的动脉粥样硬化在颈动脉、腹主动脉中均可观察到[26]。在造模技术发展的初始阶段，我们经常使用大鼠来建造动脉粥样硬化模型，但是随着实验技术的成熟，大鼠作为动脉粥样硬化模型的缺点逐渐暴露出来。大鼠的生理结构和人体是有一定差别的，有些在大鼠身上验证的动脉粥样硬化理论在人体中并不适用，而且随着小鼠在动脉粥样硬化模型中的应用越来越成熟，大鼠模型的应用越来越少了。

1.4 其他类型的动脉粥样硬化模型 除了兔子，小鼠和大鼠以外，还有一些动物被用于动脉粥样硬化实验中，如狗、猪、猴子等大型动物。灵长类动物由于与人类的生理结构比较相似，得出的结论在人体有较高的适用性，故用灵长类动物比如猴作为动脉粥样硬化模型也是较常用到的[27]。但大型动物的缺点是造价昂贵，体型也较大，不好操作，所以这类动物在实际的动脉粥样硬化造模使用时会受到限制。

总之，在动物动脉粥样硬化造模过程中，会选用不同的方式，主要目的是通过不同方式造成动物动脉壁内脂质沉积，这些方式包括高脂喂养、手术方式造成的内皮损伤、基因敲除等手段。

2 动脉粥样硬化的细胞模型

在动脉粥样硬化相关实验中，很多时候会涉及到细胞实验，例如一些分子机制可能要在细胞上进行验证，所以了解动脉粥样硬化的细胞模型也很重要。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)是动脉粥样硬化细胞模型中常用到的一种细胞。与动物模型类似，在细胞中加入某种因子可以促进细胞内的炎症反应，形成类似于动脉粥样硬化的过程。如脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子(TNF)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)等都是典型的促炎因子[28]，都可以增加细胞内的炎症反应。

LPS是动脉粥样硬化实验中常用于诱导细胞炎症的一个试剂。在该模型中，LPS的浓度一般采用10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/mg不等，加入LPS 24 h后通过PCR或者蛋白质印记(Western blot)等实验技术观察到该模型中的炎症因子如白介素、细胞间黏附因子-1(ICAM-1)、血管间黏附因子-1(VCAM-1)等炎症因子的表达增加[29]。ox-LDL在诱导HUVEC的炎症反应中常用的浓度10 μg/ml、50 μg/ml/100 μg/ml等浓度孵育24 h[30，31]，会检测到炎症因子增加。根据动脉粥样硬化的形成原理，在细胞中加入这些因子，目的就是加快细胞内的炎症反应或者脂质沉积等来加速动脉粥样硬化的形成[32]。TNF-α的常用剂量是10 ng/ml、50 ng/ml培养6 h[33，34]。在细胞实验中，除了可以直接加入一些促炎因子外，还可以引起通过细胞转染在基因水平促进细胞动脉粥样硬化的炎症反应，如siTNF-α[35]。在细胞动脉粥样硬化模型中，HUVEC是常用的一种细胞，除此之外，常用的细胞还有巨噬细胞(THP-1)[36]、树突状细胞(DC)[37]等，不同的细胞造模的方式相似，这些细胞均通过加入外部刺激因素促进细胞内的炎症反应，被广泛用于与炎症相关的信号通路、药物效应等。

3 小 结

动脉粥样硬化的一个主要原因是内皮损伤和慢性炎症，在动脉粥样硬化的模型中，我们根据动脉粥样硬化的形成原因对动物或者细胞进行干预，进而建造我们需要的模型。利用这样的模型来验证我们提出的跟动脉粥样硬化相关的一系列问题，进而解决在临床中可能遇到的一些问题，例如一些抗动脉粥样硬化通路，为脑卒中等心脑血管疾病的治疗提供思路[38]。在动脉粥样硬化相关研究中，成功造模是实验开始的前提，所以我们要根据自己想要的模型特点和要研究的课题来选择合适的模型。