基因工程猪红细胞替代人红细胞治疗贫血疾病的进展

崔烨华　王毅

[摘要] 目前，血液制品短缺是一项世界性难题。其中，一些疾病如镰刀型贫血等疾病需要反复输注红细胞治疗，由此增加了患者发生致敏和溶血性输血反应等不良反应，也更加限制了他们对供体血液的选择范围。为了解决这些问题，异种输血是潜在的解决方案之一，而猪红细胞（pRBCs）因为与人红细胞具有多重相似性而受到广泛的关注。然而，由于猪的红细胞上天然存在3种已知的碳水化合物的异种抗原（半乳糖-α1，3-半乳糖[Gal]，N-羟乙酰神经氨酸[Neu5Gc]，β-1，4-N-乙酰基-半乳糖胺基转移酶2[Sda]），单纯的异种输血是不可行的。最近，随着基因工程猪技术的发展，已实现了敲除猪体内特异性抗原的能力，以减少人类体液和细胞免疫反应的发生。该文主要总结了异种输血的起源、最新研究进展以及实现异种输血需要克服的障碍等问题。

[关键词] 红细胞;异种输血;猪红细胞;基因工程

[中图分类号] R556          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-0742（2020）11（a）-0196-03

Progress of Genetically Engineered Pig Red Blood Cells to Replace Human Red Blood Cells to Treat Anemia

CUI Ye-hua1， WANG Yi2

1.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Nanhua University， Hengyang， Hunan Province， 421001 China; 2.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou， Hainan Province， 570311 China

[Abstract] At present， the shortage of blood products is a worldwide problem. Among them， some diseases， such as sickle-type anemia， require repeated red blood cell transfusion， which increases the patient's adverse reactions such as sensitization and hemolytic transfusion reactions， and also limits their choice of donor blood. To solve these problems， heterologous blood transfusion is one of the potential solutions， and porcine red blood cells （pRBCs） have received widespread attention because of their multiple similarities with human red blood cells. However， due to the natural existence of three known carbohydrate heterologous antigens （galactose-α1，3-galactose [Gal]， N-glycolylneuraminic acid [Neu5Gc]， β-1，4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 [Sda]）， pure heterogeneous blood transfusion is not feasible. Recently， with the development of genetically engineered pig technology， the ability to knock out specific antigens in pigs has been achieved to reduce the occurrence of human humoral and cellular immune responses. This article mainly summarizes the origin of heterogeneous blood transfusion， the latest research progress， and the obstacles that need to be overcome to achieve heterogeneous blood transfusion.

[Key words] Red blood cells;Heterologous blood transfusion;Pig red blood cells;Genetic engineering

紅细胞血液制品在急救复苏、大型危重手术和慢性血液疾病上的治疗可谓是重中之重，但随着对血液需求量的上升，血液制品的供需平衡遭到了破坏，各大医院以及输血中心经常会出现供不应求的情况，用血紧张是目前临床上公认的问题。近几年来，寻找新的血液制品替代品已成为热门的研究方向，由于种种原因，例如后代的数量、器官的大小以及与人类的功能相似性，猪被认为是跨物种移植（异种移植）或输血（异种输血）的最佳器官和细胞来源而受到了广泛的关注。该综述涵盖了2011年5月—2020年4月世界范围内14篇关于异种红细胞输注的研究文章，从猪红细胞所具备的优点、实验动物模型的选择以及异种红细胞输注所面临困难的几个方面，浅要地分析了基因工程猪红细胞作为新型血液制品替代品的可行性，为解决世界范围内红细胞短缺的问题提供了新的思路。

1  介绍

1.1  异种输血的起源

使用非人类动物血液制品替代人血液制品治疗可追溯到1667年，且一直持续到20世纪初，早期的异种输血血液制品为异种来源，1665年Richard Low仅使用两只狗进行了最初的动物红细胞输注的实验研究。而第一次用于人类身上的异种输血发生在1667年，当时法国路易十四国王的医生将一只羔羊的血液输入至一名高烧的年轻男子身上，随后患者出现了反复的流血现象[1]，在现代称这种现象叫做急性溶血反应。

1.2  血液的供应、需求及安全

根据WHO世界卫生组织的最新报告，每年可以收集大约1.12亿献血者的血液，但这远远满足不了全球血液的需求量，其中又以O型血的短缺最为严重[2]。而在人类免疫缺陷病毒（HIV）高发的国家，血液制品短缺的情况就越发严峻。同时对于需要反复接受红细胞输注治疗的患者（如镰刀型贫血等）而言，长期的慢性输血史使其体内具有远高于一般健康人表达水平的同种异型免疫抗体，其原因可能是因为大多数镰刀型贫血（SCD）患者是非洲裔美国人，他们绝大多数的RH血型表型为RH D+C-E-c+e+，但由于大多数捐血者是美国白人，只有不到2%的美国白人RH血型与之相同[3]。因此，寻找新的血液制品替代品已成为亟待解决的问题。

1.3  猪红细胞作为一种新的血液替代品

鉴于上述种种问题，人类红细胞血液制品的新型替代品引起了高度关注，其中猪作为异种器官移植及异种输血的供体受到的关注度最高。猪作为异种输血的供体有以下几个优点：①猪红细胞的平均寿命稍短于人红细胞（猪红细胞平均89 d，人红细胞平均120 d），但二者红细胞的直径和计数差别不大;②猪与人血红蛋白具有相似的三维结构，猪的血型系统是AO（H）系统，和人类的ABO系统亦松散相关联， 而且许多“次要”血型抗原（例如Kell血型抗原）似乎没有在猪红细胞表面上表达[4];③猪在无菌环境下相对容易繁殖和成熟，其高繁殖能力提供了取之不尽，用之不竭红细胞;④相关报道表明[1]猪基本上没有对人类有致病性的细菌、真菌和寄生虫，虽然猪器官可能存在异种逆转录病毒引入人体的风险，但由于成熟的红细胞并没有细胞核，所以规避了该风险。根据相关的实验报告[5]，通过必要的筛查方案和猪群必须的生物安全性住房检查，与人类捐赠者相比，猪异种移植传播传染病的风险要低许多。综上所述，猪红细胞可能是作为人类红细胞血液制品替代品进行异种输血的最优选择。

2  免疫障碍

想真正将猪红细胞（pRBC）用于临床输血之前，首当其冲需要解决的问题是免疫学问题。野生猪身上天然存在Gal、Neu5Gc和 Sda 3种异种抗原，而人类细胞表面并没有表达这3类抗原，所以血清中存在3者的天然抗体，旧世界非人类灵长类动物（OWNHP）如狒狒的红细胞只存在Neu5Gc抗原，不存在Gal和Sda抗原，所以和人类一样，血清中天然表达Gal以及Sda抗体[6]。如果将野生型的pRBCs输入灵长类动物体内，则会因为野生猪天然存在的3种异种抗原（Gal， Neu5Gc 和 Sda），立即引起抗原抗体结合，导致免疫系统排斥反应。其中Gal是末端上的寡糖结构，是灵长类动物抗体的主要靶抗原，故将存在Gal抗原的猪红细胞、组织和器官作为供体移植给人类或NHP（非人灵长类动物），会迅速激活补体，导致快速炎症反应和凝血功能失调，使细胞损伤裂解并死亡，加速HAR（超急性排斥反应）的发生。HAR会导致移植物被迅速清除，类似于人类ABO血型不相容的结果[7-8]。除此之外，人类有另外2种天然存在的抗体（Neu5Gc和 Sda），尽管细胞毒性较抗Gal抗体小，却能在体外快速启动补体介导的猪细胞裂解反应和NPH对猪器官的异种排斥反应。相关实验室使用GTKO（Gal基因敲除）供体的器官消除了Gal抗体介导的异种移植物排斥反应，却依然没有消除其他异种抗原介导的排斥反应，强调了其他异种抗原对异种移植的重要性和关联性[9]。

3  TKO基因工程猪的获得与前景

随着基因工程技术的发展，获得3种异种抗原基因均敲除（TKO）的猪成为可能。如果要将pRBC成功输入人体， TKO猪可能是更好的选择。流式细胞仪分析显示，每敲除一个异种抗原基因，其血清抗原抗体结合水平就随之降低。当使用GTKO、Gal/Neu5Gc抗原敲除以及 TKO豬的RBCs和PBMC（外周血单核细胞）分别与人类血清相结合时，TKO的猪与人血清的IgM（免疫球蛋白M）及IgG（免疫球蛋白G）抗体结合比率远低于GTKO pRBC与人血清结合的比率，并且和人ABO血型相容（阴性对照组）的结合结果差异并不明显[10-11]。这表明具有更低的抗原抗体结合水平TKO猪是更好供体的选择，相关实验报道同样证实了TKO基因猪是人类生物人工心脏瓣膜理想的替代品[12]。未来异种移植的动物研究模型，应该要基于具有低水平抗体结合和水平的TKO猪作为背景，调节补体和抗凝血机制，以最大限度延长移植物的存活时间。

4  TKO猪异种实验的非人灵长类动物模型选择研究

目前，狒狒或者其他OWNHP已被确定为异种移植模型中的可靠宿主，因为它们表达与人类相似的蛋白质，但旧世界猴子仍然在一个重要方面和人类不同，即它们表达Neu5Gc抗原（人类不表达），因此不产生抗Neu5Gc抗体，所以旧世界猴对于研究Gal以及Sda抗原是一个合适的模型，但它们不适合用于研究表达（或不表达）猪Neu5Gc的模型。当使用TKO猪作为供体，会发现TKO猪与狒狒血清的抗体结合水平远高于TKO猪与人类血清的结合水平，与TKO猪低水平抗体的实验预期不相符。究其原因可能是在未知第4种抗原在敲除3种基因后得到了表达并与狒狒血清中的未知抗体结合，而人类并没有此类抗体[13]。所以使用狒狒作为TKO猪移植受体时，可能很难得到实验预期的结果。而卷尾猴（capuchin）这类NWHNP（新世界非人灵长类动物）在红细胞上完全和人类一样不表达Gal、Neu5Gc和Sda[6]，更加贴近人类异种抗原表达情况。受限于卷尾猴体型等其他原因，缺乏作为大型异种器官移植动物模型的经验，但对于组织以及红细胞异种移植，尤其是TKO基因型猪作为供体时，卷尾猴更加优于狒狒及其他旧世界猴子模型，是更理想的动物实验研究模型。

5  结论

寻找新的红细胞血液替代制品是解决全世界血液供应短缺最有效的办法之一，目前新的血液替代制品的研究主要为两条发展思路，分别是寻找及研发血红蛋白类携氧载体以及使用异种来源的红细胞，而异种输血所面临的问题则主要是由天然的异种抗原抗体所介导的免疫排斥反应。随着近几年基因工程技术的发展，使得通过基因敲除技術培育出细胞表面天然不表达异种抗原（Gal、Neu5Gc、Sda）的猪成为可能，即我们常说的TKO猪（三重基因敲除猪）。因为TKO猪红细胞具有与人类血清极低的抗原抗体结合率[10-11]，使得TKO 猪红细胞作为新型红细胞血液制品的理想选择而受到人们广泛的关注，特别是对输血有着严格限制以及长期需要进行红细胞输注治疗的慢性疾病患者而言，由于猪红细胞表面不会表达次要血型抗原，以及可通过基因工程人为地选择敲除掉猪红细胞主要抗原[4]，猪红细胞比起普通血液制品可以更有效地降低慢性血液疾病患者中同种免疫的发生率，以减少溶血反应，对于某些疾病来说猪红细胞可能是更好的选择。但狒狒这类旧世界猴由于细胞表面天然表达Neu5Gc抗原（人类不表达），所以并不适合作为研究表达（或不表达）猪Neu5Gc的动物模型。为此选择使用与人类红细胞抗原表达更为接近的卷尾猴（即红细胞表面天然不表达Gal、Neu5Gc和Sda）可能是更好的选择[6]，当使用TKO猪作为红细胞供体时，卷尾猴比起狒狒更加适合作为异种红细胞输注的移植受体。但在真正实行猪异种红细胞输注的初步临床试验之前，依然存在一些不足需要进一步完善，如证明猪红细胞完全没有人畜共患病;证明使用过猪红细胞血液制品的人不会影响将来人与人同种之间的输血;明确血液等渗性的微小差异等因素是否会影响猪红细胞的存活率;确定猪红细胞存储的最佳时间和最佳条件;以及一些伦理及地域文化问题。但我们相信，在不久的将来，猪红细胞会被进一步证明是人类红细胞新型血液制品的替代品中较好的选择。

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（收稿日期：2020-08-09）

[作者简介] 崔烨华（1992-），男，硕士在读，研究方向为异种移植。

[通信作者] 王毅（1964-），男，博士，教授，研究方向为异种移植，E-mail：wayne0108@126.com。