不同向日葵品种根系分泌物对向日葵列当萌发的刺激作用

邸 娜 郑 娜 韩海军 王 靖 崔 超 郑喜清

（1河套学院农学系，015000，内蒙古巴彦淖尔；2内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，010018，内蒙古呼和浩特；3巴彦淖尔市农牧业技术推广中心，015000，内蒙古巴彦淖尔）

向日葵列当（Orobanche cumanaWallr.）是列当科列当属的一年生全寄生草本植物[1]，其茎直立，单生，肉质，黄褐色至褐色，无叶绿素，没有真正的根，以短须状的假根侵入寄主植物根部，完全依靠吸收寄主的养分和水分生存生长[2-3]。向日葵列当寄主范围广泛，可寄生于向日葵、番茄、烟草和瓜类等农作物，其中向日葵是其主要的寄主植物[4-5]。

向日葵是我国主要的油料作物，内蒙古是我国最大的向日葵生产区。调查显示，向日葵列当在内蒙古各地发生面积逐年扩大，危害程度日益加重，仅2012年巴彦淖尔市向日葵列当发生面积就超过1.33万hm2，部分向日葵列当平均寄生率达72%以上，导致向日葵减产30%～45%，严重地块列当寄生率达90%以上[6]，单株向日葵列当寄生量最多达345株[7]。向日葵列当已成为制约巴彦淖尔市向日葵产业健康持续发展的最大瓶颈。

目前，关于向日葵列当的防治方法主要集中在化学防治、物理防治、生物防治、诱杀和诱捕作物的应用、抗性品种选育等方面，其中抗性品种选育被认为是最简便易行、经济有效的方法[8]。利用向日葵列当萌发必须依靠寄主萌发刺激物诱导的特性，研究不同列当抗性的向日葵品种根系分泌物对向日葵列当萌发诱导的差异，探究不同向日葵品种对列当抗性差异响应的机制，以期为向日葵列当抗性品种的选育和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗列当向日葵品种选用TP-3313（来自北京绿冠草业股份有限责任公司），耐列当向日葵品种选用SH363-M（来自三瑞农业科技股份有限公司），感列当向日葵品种选用3638C（来自乌拉特前旗新世种业有限责任公司）。向日葵种子均采购于内蒙古巴彦淖尔市临河区农资市场；向日葵列当种子于2018年采集于临河黄河大桥河滩地。

1.2 试验方法

1.2.1 根系分泌物的收集与提取 采用土培法收集根系分泌物。在塑料花盆中放入田园土，为加固、保护和方便移动，将装有田园土的塑料花盆置于老式泥瓦花盆中。每个花盆保留1株向日葵幼苗，置于室外培养，模拟自然生长条件，培养至现蕾期。设3个重复，每个重复20盆。

选取现蕾期长势一致的10株向日葵，剪开塑料花盆，小心取出向日葵植株，注意保护根系，以免根系因受伤发生应激反应而影响根系分泌物的组分和含量；用自来水冲掉泥沙，再采用根系淋溶法用蒸馏水充分淋洗根部，吸干水分，将其浸泡于装有2L 0.5mmol/L CaCl2溶液的烧杯中，在烧杯基部及杯口用黑色卡纸进行遮光处理，置于光照充足的条件下培养4h[9]，即得到向日葵根系分泌物粗提液。用旋转蒸发仪将根系分泌物粗提液浓缩至约1L，用二氯甲烷萃取，过滤后的萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩，定容至25mL，即为向日葵根系分泌物原液。

1.2.2 向日葵列当种子的表面消毒 过筛处理向日葵列当种子，去掉灰尘和杂质，然后装入茶袋，置于70%乙醇中浸泡30～60s，在2% Tween-20和2%NaClO（1∶1）混合液中浸泡10min，期间用玻璃棒不断搅拌，用无菌水冲洗6～8次，用无菌滤纸吸干水分，置于超净工作台晾干备用。

1.2.3 向日葵列当种子的预培养 取经灭菌的直径5cm的培养皿，放入2层无菌滤纸，加入25mg/L赤霉素溶液1.5mL，均匀放置8～10个直径5mm的无菌玻璃纤维滤纸小圆片，用接种针蘸取少量向日葵列当种子，均匀涂在玻璃纤维滤纸小圆片上，每片60～90粒种子，加盖并用Para film封口膜封口，置于25℃培养箱中，黑暗条件下倒置培养7d。

1.2.4 向日葵列当种子的培养 将预培养后的向日葵列当种子（小圆片）置于无菌滤纸上，吸掉多余的预培养液。取直径为5cm的无菌培养皿，放入2层无菌滤纸，将上述小圆片均匀放入其中，加入20μL萌发刺激物，待二氯甲烷挥发后，加入1.5mL蒸馏水，用Para film封口膜封口，将其置于25℃培养箱黑暗条件下倒置培养10d。以蒸馏水为阴性对照（CK1），以脱氢木香内酯（1×10-4mg/mL）为阳性对照（CK2），每个处理重复3次，统计向日葵列当种子的萌发率。

1.2.5 根系分泌物处理 以蒸馏水为阴性对照（CK1），以1×10-4mg/mL脱氢木香内酯为阳性对照（CK2），以根系分泌物原液（T0）和根系分泌物原液稀释 20（T20）、50（T50）、75（T75）、100（T100）、150（T150）和200倍（T200）液作为萌发刺激物。分别选择列当萌发率最高的3种向日葵根系分泌物稀释液作为萌发刺激物。

1.2.6 根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用 以向日葵根系分泌物与脱氢木香内酯混合液作为萌发刺激物，使培养皿中脱氢木香内酯的浓度为1×10-4mg/mL，根系分泌物的浓度为刺激向日葵列当萌发的最有效浓度（以“1.2.5”试验结果为判断依据）。

1.2.7 向日葵列当种子萌发率的统计 使用连续变倍体显微镜统计每个玻璃纤维滤纸上向日葵列当的萌发种子数及种子总数，计算萌发率，取平均值作为该处理的向日葵列当种子萌发率。萌发率（%）=（视野中列当萌发种子数/视野中列当种子总数）×100。

1.2.8 数据分析 采用SPSS 23.0进行方差分析，Microsoft Excel 2013进行数据处理和图表绘制。

2 结果与分析

2.1 向日葵根系分泌物稀释倍数对向日葵列当种子萌发的影响

分别以TP-3313、SH363-M和3638C的根系分泌物原液及系列稀释液处理向日葵列当种子，其种子萌发率见表1。阴性对照CK1向日葵列当种子的萌发率平均仅为4.92%，阳性对照CK2，即脱氢木香内酯处理平均为63.89%，说明向日葵列当需在萌发刺激物的作用下才能萌发。3个向日葵品种根系分泌物对向日葵列当种子萌发的影响均表现为随根系分泌物稀释倍数的增加，种子萌发率呈现先升高后降低的趋势，但在各处理条件下，向日葵列当的萌发率均小于CK2、大于CK1，说明3个向日葵品种根系分泌物中均具有促进向日葵列当萌发的物质，只是促进效果不及脱氢木香内酯。

表1 不同稀释倍数向日葵根系分泌物对向日葵列当种子萌发率的影响Table 1 Effects of dilution multiples of sun flower root exudates on germination rate of sun flower broomrape seeds %

当TP-3313和SH363-M根系分泌物稀释50倍时，萌发率均达到最大，分别为23.00%和27.99%，而3638C根系分泌物稀释75倍时，萌发率达到最大，为34.59%，均显著高于根系分泌物原液处理下的萌发率，说明高浓度的根系分泌物对向日葵列当的萌发具有一定的抑制作用，且感列当向日葵品种根系分泌物中促进萌发的物质含量可能相对较高，因此需要较高的稀释倍数才能达到最大萌发率。其后，随根系分泌物稀释倍数的增加，各处理向日葵列当萌发率显著下降，尤其是稀释200倍时，萌发率接近CK1萌发率，说明随着稀释倍数的增加，根系分泌物中促进向日葵列当萌发的物质含量显著降低，其中TP-3313和SH363-M T200处理的萌发率与CK1无显著差异，说明稀释200倍时，对向日葵列当萌发不具有诱导作用；而3638C根系分泌物在稀释200倍时，萌发率虽然也显著下降，但仍显著高于CK1，说明感列当向日葵根系分泌物稀释200倍时仍具有促进列当萌发的作用。

2.2 不同列当抗性向日葵品种根系分泌物对向日葵列当种子萌发的影响

图1 不同列当抗性向日葵品种根系分泌物对向日葵列当种子萌发的影响Fig.1 Effects of different resistant sun flower root exudates on the germination of sun flower broomrape seeds

分别选择萌发率最高的TP-3313和SH363-M根系分泌物50倍液、3638C根系分泌物75倍液作为萌发刺激物处理向日葵列当，以无菌水为阴性对照CK1，以脱氢木香内酯为阳性对照CK2，比较不同列当抗性向日葵根系分泌物对向日葵列当萌发刺激效果的差异性。结果（图1）显示，TP-3313、SH363-M和3638C根系分泌物处理的向日葵列当萌发率均小于CK2，大于CK1，说明3个抗性向日葵品种根系分泌物均具有促进向日葵列当萌发的作用，只是促进效果不同。其中，TP-3313处理的萌发率最低（24.43%），3638C处理的萌发率最高（36.75%），SH363-M处理的萌发率居中（29.22%），说明抗列当向日葵根系分泌物对向日葵列当的萌发刺激效果较差，感列当向日葵根系分泌物的刺激效果较好，而耐列当向日葵根系分泌物的刺激效果居中，这可能是由于不同列当抗性向日葵根系分泌物中能够刺激向日葵列当萌发的物质含量或种类不同，从而使得向日葵对向日葵列当的抗性表现上存在一定差异。

2.3 不同向日葵品种根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用对向日葵列当种子萌发的影响

3种不同向日葵根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用处理向日葵列当，进一步研究向日葵对向日葵列当抗性差异的机制，结果见图2。脱氢木香内酯与TP-3313共同作用时，萌发率为52.95%，比TP-3313单独作用时的萌发率高29.57%，但比CK2萌发率低12.2%；脱氢木香内酯与SH363-M共同作用时，萌发率为56.13%，比SH363-M单独作用时的萌发率高27.38%，比CK2萌发率低9.02%，说明抗列当和耐列当向日葵品种根系分泌物中可能含有抑制向日葵列当萌发的物质；耐列当向日葵品种根系分泌物作用下，无论是与脱氢木香内酯共同作用还是单独作用，其萌发率都显著高于抗列当向日葵品种根系分泌物，可能是由于耐列当向日葵品种根系分泌物中含有能够抑制向日葵列当萌发的物质含量低于抗列当向日葵品种根系分泌物，或与抗列当向日葵品种根系分泌物中抑制列当萌发的物质组分不同，从而使2个向日葵品种对列当的抗性表现有所差异。3638C根系分泌物单独作用及其与脱氢木香内酯共同作用处理的萌发率均显著高于TP-3313和SH363-M，并且共同作用处理比脱氢木香内酯单独作用的萌发率还高5.2%，进一步说明感列当向日葵的根系分泌物中存在促进向日葵列当萌发的物质。

图2 不同向日葵品种根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用对向日葵列当种子萌发率的影响Fig.2 The combined effects of the different resistant sun flower root exudates and dehydroxylolactone on germination rate of sun flower broomrape seeds

3 讨论

上述试验结果表明，根系分泌物的稀释倍数对向日葵列当的萌发具有显著影响，其中TP-3313和SH363-M根系分泌物均在稀释50倍时达到最大萌发率，而3638C根系分泌物需稀释75倍时才能达到最大萌发率；不同列当抗性的向日葵根系分泌物诱导向日葵列当萌发的效果不同，向日葵列当萌发率表现为TP-3313＜SH363-M＜3638C；不同列当抗性向日葵根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用时，TP-3313和SH363-M根系分泌物降低脱氢木香内酯对向日葵列当萌发的促进作用，而3638C根系分泌物则增强了脱氢木香内酯对向日葵列当萌发的促进作用。

植物根系分泌物的化学成分复杂，其中多种成分属于化感物质。寄生植物与寄主间的化感作用与寄主的根系分泌物成分和浓度密切相关。研究表明，不同植物根系分泌物的成分不同，其化感效应不同，且即使是同一植物的根系分泌物，浓度不同化感效应也不相同，甚至表现出相反的作用效果[10-11]。本试验研究发现，3个向日葵品种根系分泌物对向日葵列当萌发的刺激效果不同，其中TP-3313的刺激效果最差，SH363-M的刺激效果居中，3638C的刺激效果最好，说明3个向日葵品种对列当的抗性表现不同是由于根系分泌物成分或刺激列当萌发的物质含量不同造成的；利用根系分泌物原液及系列稀释液刺激向日葵列当萌发，随着根系分泌物稀释倍数增加，TP-3313、SH363-M和3638C处理下的列当萌发率均表现为先升高后降低的趋势，说明根系分泌物对向日葵列当萌发的刺激效果表现为高抑低促，但浓度过低则不足以刺激向日葵列当萌发，任祥祥[12]和君睿红等[13]也得到了类似结论。

向日葵列当必须在有萌发刺激物的作用下才能萌发，否则即使环境条件适宜也不会萌发[14]。本研究发现，抗列当、耐列当和感列当向日葵根系分泌物均具有诱导向日葵列当萌发的作用，其中抗列当向日葵的诱导效果最差，感列当向日葵的诱导效果最好，耐列当向日葵的诱导效果居中，这与三者对向日葵列当的抗性表现一致，说明3种向日葵根系分泌物中均含有向日葵列当萌发的刺激物，但含量有所差异，表现为抗列当向日葵最少，感列当向日葵最多，耐列当向日葵居中，这与任祥祥等[8，12]的研究结果一致。通过田间抗列当品种筛选，TP-3313为向日葵列当免疫品种[15-17]，萌发试验中TP-3313诱导向日葵列当萌发率最高达24.43%，说明其虽然能够诱导向日葵列当萌发，但萌发后的列当不能与其建立寄生关系，推测可能是由于向日葵列当诱导TP-3313根部组织结构发生变化，使其对列当产生了结构抗性，从而使其在田间栽培过程中表现出对向日葵列当的免疫特性。Dorr等[18]研究发现，抗列当向日葵可通过根部皮层薄壁细胞细胞壁发生木栓化和木质化加厚来阻止列当的侵染；Eizenberg等[19]将列当种子分别接种于抗列当和感列当向日葵品种，发现列当种子都能萌发，但抗列当品种根系形态结构发生变化，列当芽管虽接触到根系，但并不能与之建立寄生关系。

TP-3313、SH363-M和3638C分别与向日葵列当萌发刺激物脱氢木香内酯共同作用于向日葵列当，TP-3313和SH363-M的根系分泌物均显著降低了脱氢木香内酯对向日葵列当的萌发刺激作用，而3638C的根系分泌物却显著增强了脱氢木香内酯的刺激作用，推测TP-3313和SH363-M根系分泌物中可能含有某些物质，抑制了脱氢木香内酯对列当萌发的刺激作用，或干扰了列当种子与脱氢木香内酯的相互识别作用，从而使得列当萌发率下降；而3638C根系分泌物成分可能与脱氢木香内酯协同作用促进向日葵列当萌发。

本研究结果证实了向日葵对列当的抗性与根系分泌物的浓度和成分有关，但不同列当抗性向日葵根系分泌物的成分及含量仍需进一步研究；同时明确了抗列当向日葵根系分泌物也含有列当萌发的刺激物，但其田间表现出的列当免疫性机理仍有待于后续研究。

4 结论

不同的向日葵根系分泌物稀释倍数对向日葵列当的萌发影响显著，整体表现为低浓度下促进萌发，高浓度下抑制萌发，具体表现为TP-3313和SH363-M根系分泌物稀释50倍时向日葵列当萌发率达到最大，而3638C根系分泌物稀释75倍时萌发率达到最大。抗、感、耐列当的向日葵品种根系分泌物对向日葵列当萌发的诱导效果不同，向日葵列当萌发率表现为TP-3313＜SH363-M＜3638C；不同列当抗性向日葵根系分泌物与脱氢木香内酯共同作用于向日葵列当，TP-3313和SH363-M根系分泌物降低了脱氢木香内酯对向日葵列当萌发的促进作用，而3638C根系分泌物增强了脱氢木香内酯对向日葵列当萌发的促进作用。