蓝靛果籽油提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

蒋一苇, 郭 娜, 刘志国, 赵春建, 付玉杰, 王希清

(东北林业大学 森林植物生态学教育部重点实验室；林业生物制剂教育部工程研究中心；化学化工与资源利用学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

蓝靛果是一种忍冬科忍冬属的小灌木植物，也可称其为蓝果忍冬、山茄子、黑瞎子果、羊奶子等[1]。野生蓝靛果主要生长在北半球北部，如中国、俄罗斯、日本、加拿大等国家[2]。在我国，蓝靛果主要分布在东北、华北和西北的一些地区，其中，东北大、小兴安岭和长白山地区的野生蓝靛果资源贮量极大[3]。蓝靛果营养丰富，因含有丰富的维生素、矿物质和多种氨基酸等，被称为“第三代水果”[4]。此外，蓝靛果中还有多种生物活性物质，如花色苷、有机酸、类黄酮和多糖等成分[5]。蓝靛果酚类提取物具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抗辐射、缓解视觉疲劳以及治疗2型糖尿病等功效[6-8]。蓝靛果营养丰富并具有促进健康的作用，是一种值得重视和推荐的功能食品[9]。目前蓝靛果籽尚未被充分利用，蓝靛果籽油的相关文献也较为罕见。用于提取植物油的常见方式有压榨法、有机溶剂浸提法和索氏提取法等。其中压榨法提取植物油所需能耗较大，出油率低，还可能破坏植物油的脂肪酸成分[10]。另外，浸提法提取植物油通常采用极性较小的有机试剂，如正己烷或石油醚，其在提取物中的残留对人体健康具有一定的不利影响[11]。且提取过程通常伴随着长时间的高温加热处理，影响油的品质[12]。无水乙醇是一种环保的绿色提取试剂，近年来，采用无水乙醇提取植物油的相关研究越来越多[13-14]。本研究以无水乙醇为提取溶剂，利用微波辅助提取法提取蓝靛果籽油，采用单因素和响应面法优化提取工艺，并进一步利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对蓝靛果籽油的脂肪酸组成和含量进行鉴定和分析，以期得出一种绿色环保、高效的蓝靛果籽油提取方法，并为蓝靛果资源的深度开发利用提供基础数据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

蓝靛果(Loniceracaeruleavar.enulisTurcz et Herd)籽来自黑龙江省七台河市；无水乙醇、石油醚，分析纯；正己烷，色谱级。

MAS-Ⅱ型微波辅助提取仪，上海新仪微波化学科技有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海青浦泸西仪器厂；Varian 450-GC/240-MS气相色谱-质谱(GC-MS)仪，美国Varian公司。

1.2 蓝靛果籽油提取工艺及优化

将蓝靛果籽水洗，挑去杂质，在40 ℃干燥箱中烘干至质量恒定，粉碎过0.178 mm筛备用。取10 g蓝靛果籽粉末，以无水乙醇为提取试剂，采用微波辅助法提取籽油。提取结束后经旋转蒸发仪减压蒸馏将乙醇与蓝靛果籽油分离。利用单因素试验分别考察了液料比、提取温度、提取时间和微波功率对出油率的影响。出油率按以下公式计算：蓝靛果籽油出油率=蓝靛果籽油质量/蓝靛果籽质量×100%

为了进一步提高出油率，在单因素试验基础上，分别选择提取时间、液料比和微波温度为响应变量，蓝靛果籽油出油率为响应值，采用BBD响应面法优化提取工艺条件。

1.3 蓝靛果籽油脂肪酸组成测定

1.3.1甲酯化条件 称取0.8 g蓝靛果籽油与6 mL甲醇混合，再加入8 mg氢氧化钾粉末，在有冷凝回流装置的80 ℃油浴锅中反应至油滴溶解。反应完全后，用正己烷和蒸馏水在分液漏斗中萃取2次，取上层正己烷层加无水硫酸钠干燥，再将过滤后的滤液减压蒸干。所得甲酯化籽油经色谱级正己烷稀释1 000～2 000倍，经10 000 r/min离心10 min后备用。

1.3.2GC-MS分析条件 采用GC-MS仪对蓝靛果籽油进行脂肪酸组成分析，配备DB-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm)。分析条件：氦气流量3 mL/min，分流比1 ∶10，注射器温度250 ℃，注射量1 μL。升温程序：从120 ℃以5 ℃/min的速率升温至200 ℃，保温5 min；以1 ℃/min的速率升温至205 ℃，保温5 min；以1 ℃/min的速率升温至210 ℃，保温5 min；以2 ℃/min 的速率升温至220 ℃，保温5 min；以5 ℃/min的速率升温至250 ℃。检测器温度300 ℃，离子源温度200 ℃，电子冲击的电离模式70 eV，扫描范围(m/z)50～500，分析结果与NIST05标准谱库检索比对，确定蓝靛果籽油的脂肪酸成分。

2 结果与分析

2.1 不同条件对微波辅助提取蓝靛果籽油的影响

2.1.1提取时间 在液料比20 ∶1(mL ∶g，下同)、提取温度50 ℃和微波功率600 W条件下，考察提取时间对微波辅助乙醇提取蓝靛果籽油出油率的影响，结果见图1(a)。由图1(a)可以看出，蓝靛果籽出油率在10～20 min呈现升高趋势，20 min后出油率略微降低，这是因为随着提取时间增加，蓝靛果籽油溶出增加，提取率升高；但时间过长则可能导致溶剂挥发，使得蓝靛果籽油溶出不充分。即提取时间在20 min 时，得到最高的蓝靛果籽油出油率。

2.1.2液料比 在提取温度60 ℃、微波功率600 W和提取时间30 min的条件下，考察液料比对微波辅助乙醇提取蓝靛果籽油出油率的影响，结果见图1(b)。由图1(b)可以看出，蓝靛果籽出油率呈现先升高后降低的趋势，这是因为溶剂用量增加能与蓝靛果籽粉充分接触，促进油脂溶解；但是乙醇过多时，作用于溶剂的微波能增加，作用于蓝靛果籽粉末的微波能相对减少[15]，使得蓝靛果籽的油脂未被完全溶解，出油率降低。当液料比值为20时，得到最高的蓝靛果籽油出油率。

a.提取时间extraction time； b.液料比liquid-to-solid ratio； c.提取温度extraction temperature； d.微波功率microwave power

2.1.3提取温度 在提取时间20 min、液料比值25和微波功率500 W的条件下，考察提取温度对微波辅助乙醇提取蓝靛果籽油出油率的影响，结果见图1(c)。由图1(c)可知，蓝靛果籽出油率呈现先增加后减少的趋势，这是由于随着温度的升高分子迁移速度加快，溶质溶解的速度也增加，蓝靛果籽油的出油率上升；但是温度过高时，能耗增加，溶剂大量流失，籽油不能完全溶出导致出油率降低。即提取温度为50 ℃时，得到最高的蓝靛果籽油出油率。

2.1.4微波功率 在提取时间20 min、液料比值20和提取温度为50 ℃的条件下，考察微波功率对微波辅助乙醇提取蓝靛果籽油出油率的影响，结果见图1(d)。由图1(d)可知，在微波功率200～500 W之间时蓝靛果籽出油率呈现上升趋势，微波功率500～600 W之间出油率基本保持稳定，这是因为微波通过解吸作用使油脂被溶解出来，微波功率提高，细胞壁迅速破裂，油脂将大量溶出，微波功率500 W时足以达到破坏蓝靛果籽结构和释放油脂的目的。即微波功率为500 W时，得到最高的蓝靛果籽油出油率。

2.2 微波辅助提取蓝靛果籽油的响应面优化

根据单因素试验结果，发现提取时间(X1)、液料比(X2)和提取温度(X3)对蓝靛果籽油提取的影响较大，选择这3个因素为响应变量，以蓝靛果籽油出油率为响应值，利用Design-Expert 8.0软件设计，进行3因素3水平响应面分析试验，试验设计及结果见表1。

表1 响应面设计及实验结果

对回归模型进行方差分析，结果见表2。

表2 回归方程方差分析

根据表2中的分析结果可知，蓝靛果籽油出油率的模型组P<0.01，模型项显著，失拟项P>0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合成功。同时，表2还可以看出实验组与模型组的相关性较好(R2=0.993)，说明所建立的模型组可以准确描述独立变量与响应值之间的关系。

蓝靛果籽油出油率的响应面曲图见图2。图2(a)为提取时间和液料比的交互作用对蓝靛果籽油出油率的影响，当提取时间一定时，蓝靛果籽油出油率随液料比升高而增加。当液料比值增大到23时，出油率最高，随着液料比继续增加，出油率降低。当液料比一定时，蓝靛果籽油出油率随提取时间延长而先增加后减少，在提取时间23 min得到最佳出油率。因此，适当提取时间和液料比对蓝靛果籽油出油率具有重要的影响。图2(b)为提取时间和提取温度的交互作用对蓝靛果籽油出油率的影响，可以看出蓝靛果籽油出油率随提取温度和提取时间的升高呈现先增加后减少趋势。图2(c)为液料比和提取温度的交互作用对蓝靛果籽油出油率的影响，可以看出蓝靛果籽油出油率随液料比和提取温度的升高先增加后减少。

a.Y=f(X1, X2)； b.Y=f(X1, X3)； c.Y=f(X2, X3)

a.微波辅助提取法microwave-assisted extraction； b.索氏提取法soxhlet extraction图3 蓝靛果籽油的GC-MS总离子流色谱图Fig.3 Representative total ion chromatography of blue honeysuckle seeds oil

结合模型拟合和回归方程进行分析，蓝靛果籽油的最佳提取条件为提取时间23.19 min、液料比值22.81和提取温度50.30 ℃，在此条件下蓝靛果籽油出油率的模型预测值为25.98%。为了便于实验，将试验参数调整为提取时间23 min、液料比值23、提取温度50 ℃和微波功率500 W，在此提取条件下进行3次验证试验，蓝靛果籽油出油率分别为25.95%、 25.99%和26.05%，平均值26%，与预测值相对标准偏差为1.41%，验证值与理论值无显著性差异。在此之前，采用索氏提取法以石油醚为提取试剂，提取4 h 所得出油率为(30.8±0.47)%。与石油醚相比，无水乙醇作为提取溶剂具有绿色安全的特点，并且本实验采用的微波辅助无水乙醇提取法可以在较短时间内达到与索氏提取法提取蓝靛果籽油接近的出油率。

2.3 蓝靛果籽油脂肪酸组成分析

采用微波辅助法和索氏提取法提取蓝靛果籽油，其中微波辅助法的提取溶剂为无水乙醇，并在2.2节最佳工艺条件下提取；索氏提取法的提取溶剂为石油醚，在80 ℃水浴下热回流提取4 h。2种方法提取得到的蓝靛果籽油的GC-MS总离子流色谱图见图3，通过GC-MS分析了2种方法提取的蓝靛果籽油中脂肪酸组成及GC含量，结果见表3(未去除溶剂峰和杂质)。

从图3可以看出，微波辅助提取法所得蓝靛果籽油的脂肪酸组成与索氏提取法相同，均主要含有7种脂肪酸，结果表明：利用微波辅助乙醇法对蓝靛果籽油提取不会对籽油的脂肪酸组成造成影响。2种提取方法所得蓝靛果籽油的主要成分都是9，顺-11，反-十八碳二烯酸和10，反-12，顺-十八碳二烯酸，这2种天然反式脂肪酸也称为共轭亚油酸，其GC含量在蓝靛果籽油中占40%以上。共轭亚油酸常来源于动物，如牛肉、乳制品等[16]，在植物中鲜有报道。近年来，随着人们对共轭亚油酸的深入研究，共轭亚油酸的多种生理活性被报道，主要包括抗癌、抗肿瘤、促进脂肪代谢、保护心脑血管、改善骨质疏松、提高机体免疫力等[17-18]。因此，共轭亚油酸不仅可以作为营养补充剂[19]，还广泛应用于功能食品领域。蓝靛果籽油中另外5种脂肪酸同样是不饱和脂肪酸，与索氏提取法的蓝靛果籽油相比，微波提取法的蓝靛果籽油中的10，反-12，顺-十八碳二烯酸含量较高，且单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量均较高，总不饱和脂肪酸GC含量达到70.774%。微波辅助乙醇提取法因具有提取时间短、提取条件相对温和的特点，可以作为提取含有较高不饱和脂肪酸含量的蓝靛果籽油的有效方法。蓝靛果籽油中高含量的不饱和脂肪酸，将对人体有多种保健功效，具有开发成为功能性油脂的潜力，也可作为植物源共轭亚油酸的原料。

表3 不同方法提取的蓝靛果籽油的脂肪酸组成及GC含量

3 结 论

3.1采用微波辅助无水乙醇提取蓝靛果籽油，通过单因素试验和响应面试验对提取工艺条件进行优化。结果发现：最佳提取工艺条件为提取时间23 min、液料比23 ∶1(mL ∶g)、提取温度50 ℃和微波功率500 W，此条件下蓝靛果籽油的出油率为(26.0±0.05)%。

3.2蓝靛果籽油经GC-MS分析表明：微波辅助提取法所得蓝靛果籽油的脂肪酸组成与索氏提取法相同，均主要含有7种脂肪酸，微波辅助乙醇提取法不会对蓝靛果籽油的脂肪酸组成造成影响。蓝靛果籽油的不饱和脂肪酸GC含量较高，其中主要成分是2种共轭亚油酸，分别为9，顺-11，反-十八碳二烯酸和10，反-12，顺-十八碳二烯酸。微波辅助无水乙醇法提取蓝靛果籽油是一种绿色高效的提取方法，为蓝靛果籽油的应用及功能性研究奠定了基础。