梅州地区客家人群HBV不同基因型分布及核苷(酸)类似物耐药位点、感染患者病情对比观察

郑志远，吴和明，李仲坚

梅州市人民医院，广东梅州 514000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球的长期公共卫生问题。在世界范围内，有超过20亿人感染过HBV和大约3.5亿人发展为慢性感染者[1,2]。慢性HBV感染是发展成终末期肝脏疾病(包括肝硬化、肝衰竭、肝癌)的一个重要危险因素，中国HBV携带者约7 800万，每年约有30万人死于HBV相关的肝硬化或肝癌[3]。目前，慢性乙型肝炎的治疗主要有干扰素和核苷(酸)类似物(NAs)两类药物[4,5]。其中NAs疗效明显，不良作用小，临床应用广泛。但长期NAs治疗有可能使得患者体内的HBV序列发生变异，导致产生的HBV聚合酶与核苷(酸)类似物结合力降低，变异的HBV不受核苷(酸)类似物的抑制或抑制能力下降从而导致治疗失败[6,7]。有研究[8,9]报道,HBV基因型和耐药突变与疾病恶化有关。研究耐药突变情况与HBV基因分型之间的关系对乙型肝炎患者的治疗有重要指导意义。HBV主要有8种基因分型(A～H)[10]，它们中大多数有独特的地域分布[11,12]。本研究以梅州地区客家人群525例慢性HBV感染患者为研究对象，观察其基因型分布情况,并比较了不同HBV基因型患者NAs耐药情况、耐药突变位点及病情，以期为慢性HBV感染患者的个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018年1～12月梅州市人民医院住院的客家人慢性HBV感染患者525例,男422例、女103例，年龄(48.31±11.27)岁；慢性乙型肝炎284例，肝硬化157例，肝癌84例。纳入标准：均符合《慢性乙型肝炎防治指南》[13]中相关诊断标准；肝癌诊断符合《原发性肝癌诊疗规范》[14]中相关诊断标准；均采用NAs治疗并都进行了HBV基因分型和耐药突变位点检测；患者临床资料完整。排除标准：患有自身免疫性肝炎、丙型肝炎、酒精性肝硬化、胆汁淤积性肝病等可引起肝脏病变的其他疾病者。本研究经过了梅州市人民医院伦理委员会批准。患者均知情同意。

1.2 血清HBV-DNA载量、HBV-DNA基因分型和耐药突变位点检测 抽取患者空腹静脉血3 mL后，采用磁珠法提取患者血液中的病毒核酸，提取过程由PerkinElmer公司Pre-NAT全自动核酸检测反应体系构建系统完成，试剂盒购自上海浩源生物技有限公司，具体操作按照试剂说明书进行。高浓度胍盐将病毒蛋白外壳裂解，释放出病毒核酸，再用对核酸具有吸附功能的磁珠将游离的病毒核酸吸附到磁珠表面。洗去未吸附上的杂质，最后将病毒核酸从磁珠上洗脱下来作为测定用模板。然后将配制好的反应混合液分装到扩增反应管中，再依次加入标本模板、阴阳对照及定量参考品。离心混匀后，采用实时荧光定量PCR仪进行核酸扩增检测出血清中HBV-DNA载量。

将直用型PCR反应液加入反应管中，再分别加入上述制备好的模板，离心混匀上机扩增。取20 μL上述PCR扩增产物至110 μL杂交液中，混匀后加入基因芯片孔中，然后分别按说明书步骤操作，最后分别用基因分型、耐药突变位点阅读仪判读HBV-DNA基因分型、HBV-DNA耐药突变位点。阳性判断标准：HBV分型检测芯片阴性对照检测为阴性、阳性对照检测为TypeB阳性、质控探针至少2个显示为阳性，则分型检测结果有效。芯片上各型别对应位置3个点中，至少2个信号点出现阳性信号即可判断为该型别为阳性。

HBV耐药突变位点检测芯片阴性对照探针检测为阴性、空白对照为阴性、阳性对照探针检测为阳性并且至少有4个显示为阳性、质控探针至少2个显示为阳性则耐药检测结果有效。芯片上HBV各型别对应位置3个点中，至少两个信号点出现阳性即可判为阳性。

1.3 血清肝功能指标及甲胎蛋白(AFP)的检测 空腹抽静脉血2 mL，用3 000 r/min离心5 min后放室温待检。采用全自动生化分析仪(AU5821，Beckman Coulter)检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)，检测试剂购自上海科华生物工程有限公司；采用化学发光免疫法检测血清AFP，仪器采用全自动化学发光仪(Architect i2000，雅培)，检测试剂购自雅培公司。

2 结果

2.1 525例客家慢性HBV感染者HBV基因型分布 525例患者中B基因型463例(88.19%)，C基因型59例(11.24%)，B+C型、B+D型和D型各1例，各占0.19%。B、C基因型慢性HBV感染者男性分别为369例(79.70%)、50例(84.75%)，年龄分别为(47.33±14.70)岁、(43.86±14.34)岁，两基因型慢性HBV感染者男性比例及年龄比较，P均>0.05。

2.2 不同基因型HBV拉米夫定、阿德福韦脂的耐药位点及耐药率 在525例客家慢性HBV感染者中，位点突变475例(90.48%)，其中HBV B基因型421例、HBV C基因型54例(由于HBV B+C型、HBV B+D型、HBV D型例数较少，未纳入统计)。525例客家慢性HBV感染者中，437例对拉米夫定耐药，18例对阿德福韦脂耐药，20例为多重耐药。

对拉米夫定耐药的437例慢性HBV感染者中，B基因型HBV耐药位点为rt180M、rt204V、rt204I、rt180M+rt204V者分别为52(13.30)、32(8.18)、22(5.63)、285例(72.89)，C基因型HBV耐药位点为rt180M、rt204V、rt204I、rt180M+rt204V者分别为12(26.09%)、1(2.17%)、4(8.70%)、29例(63.04%)，B基因型HBV耐药位点为rt180M+rt204V者的比例最高。

对阿德福韦酯耐药的18例慢性HBV感染者中，B基因型HBV耐药位点为rt181V、rt181T、rt236T、rt181V+rt181T者分别为3、2、5、1例，C基因型HBV耐药位点为rt181V、rt181T、rt236T、rt181V+rt181T者分别为2、1、3、1例。B基因型HBV耐药位点为rt236T者的比例最高。

284例慢性乙型肝炎患者中，耐药者为259例(91.20%)；154例肝硬化患者中，耐药者为141例(91.56%)；84 例肝癌患者中，耐药者为75例(89.29%)，三者之间耐药率比较，P>0.05。

2.3 不同基因型HBV慢性感染者血清AST、ALT、AFP、HBV-DNA及肝硬化、肝癌比例比较 B基因型HBV慢性感染者AST、ALT、AFP、HBV-DNA水平分别为(181.25±49.53)IU/L、(184.93±27.47)IU/L、(111.33±14.55)ng/mL、(5.15±1.66)IU/mL。C基因型HBV慢性感染者AST、ALT、AFP、HBV-DNA分别为(177.34±37.07)IU/L、(310.32±39.77)IU/L、(107.50±10.44)ng/mL、(5.23±1.72)IU/mL。 B、C基因型HBV慢性感染者血清AST、AFP、HBV-DNA水平比较，P均>0.05；血清ALT水平比较，P<0.05。

B基因型HBV慢性感染者中，慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌者分别为276(97.18%)、120(77.92%)、67例(79.76%)，C基因型分别为8(2.82%)、34(22.08%)、17例(20.24%)，C基因型肝硬化、肝癌的比例高于B基因型(P均<0.05)。

3 讨论

HBV是闭合环状的双链DNA病毒[15,16]。它最显著的生物学特征就是变异率高。HBV的4个基因S、C、P和X在自然条件下均可发生变异[17,18]。这些变异引起病毒的生物学改变，导致变异后病毒感染者血清HBeAg阴性，但HBV仍在复制，引起免疫逃逸。此外，慢性HBV感染者需要长时间甚至终身抗病毒治疗，使得病毒被持续抑制。这样，很多患者中就不可避免地出现耐药突变体，从而导致了病毒学和生化突破。耐药突变体的发展也大大降低了治疗慢性HBV感染的功效，使疾病进展和肝衰竭的风险增加[19，20]。

通过对不同HBV基因型之间的性别、年龄、AST、ALT、AFP和HBV-DNA载量的比较发现B基因型和C基因型HBV慢性感染者的ALT水平比较差异有统计学意义。ALT是反映肝脏功能的重要指标，C基因型HBV慢性感染者的ALT值高于B基因型，说明C基因型HBV慢性感染者肝细胞进行性坏死程度更大，与曾华等[21]研究结果相符。临床常用干扰素和NAs进行抗病毒治疗，对于长期使用NAs治疗的患者，对其进行HBV基因型和耐药突变位点的检测，有助于临床医生了解患者疾病的发展情况，为其及时调整用药。本研究中，对拉米夫定耐药的437例患者中以B基因型为主，耐药位点以rt180M+rt204V最多见，患者的耐药比例最高为72.89%。说明拉米夫定已严重耐药，不再适合作为临床的一线用药。对阿德福韦脂耐药的18例中以B基因型为主，耐药位点以rt236T最多见，耐药患者比例最高为45.45%，提示阿德福韦单独应用的耐药发生率也较高。我们还发现HBV基因型B和C在肝硬化、肝癌的分布差异有统计学意义。C基因型慢性HBV感染患者发展为肝硬化、肝癌的比例远高于B基因型慢性HBV感染患者，与文献[22,23]报道一致。这可能与C基因型HBV的高复制能力导致HBV DNA和病毒抗原在细胞内聚集，从而引起肝细胞损伤有关；也与C基因型HBV患者易产生自发性酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸变异密切相关[24,25]。HBV基因型分布具有地域性，我国以B、C基因型为主，本研究中，525例梅州客家慢性HBV感染患者中，基因型以B型为主，与以往研究[26]结果一致。

综上所述，梅州地区客家人群HBV基因型以B基因型为主。HBV B基因型慢性感染者拉米夫定耐药位点以rt180M+rt204V最为多见，阿德福韦酯耐药位点以rt236T最为多见。HBV B基因型慢性感染患者病情轻于C基因型。本研究还存在一定的局限性。首先，我们对HBV基因型和耐药位点的分析只是基于一个血液样本获得的研究资料。因此，无法评估HBV基因型或耐药位点变化对疾病发展的影响。其次，入选的样本都是住院客家患者，病情偏重，可能造成选择性偏倚。