糖尿病肾病中表达上调miRNA在肾脏内皮-间充质转化中的调控机制研究进展

袁芸，胡琼英

1成都中医药大学，成都611137；2成都中医药大学附属医院

糖尿病肾病(DKD)是常见的糖尿病并发症，是糖尿病微血管并发症和终末期肾脏疾病的主要病因[1]。在多种致病因素单独或协同作用下，DKD患者的肾组织将会发生一系列病理性改变，包括肾小球基底膜增厚、足突融合、足细胞丢失、系膜基质扩张及细胞外基质(ECM)沉积等，最终导致终末期肾脏疾病[2]。内皮-间充质转化(EndMT)是内皮细胞在细胞因子刺激下，失去固有表型逐渐转化为间充质样细胞的过程，在各种纤维化疾病中发挥重要作用[3]。有学者在经典肾纤维化模型中研究发现，成纤维细胞可由内皮细胞发生间充质转化而来[4]。这一实验结果反映出成纤维细胞的异质性，除了原本驻留的成纤维细胞外，内皮细胞也可成为其潜在前体，仅仅阻断成纤维细胞活化不足以阻止肾纤维化的进展，如何控制内皮细胞的这种特殊转化也至关重要。微小RNA(miRNA)是一种广泛分布、长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，成熟的单链miRNA结合mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)介导靶基因转录后的基因沉默，从而诱导mRNA降解或抑制蛋白翻译[5]。大量研究发现，体内差异性表达的miRNA参与心脏、肾、肝、肺等器官纤维化，通过抑制或促进各种基因和蛋白的活性，影响EndMT诱导的纤维化[6]。miRNA对DKD和肾纤维化的调控是多途径的。本文现就糖尿病肾病中表达上调的miRNA在肾脏EndMT中的调控机制相关研究作一综述，以期加深对DKD肾纤维化发病机制的了解，为其诊断和靶向治疗提供新的生物标志物。

1 miR-21

在哺乳动物细胞中，miR-21是miRNA家族中表达最高的成员之一。Assmann等[7]对58例1型糖尿病患者(含23例对照组患者，18例中度DKD患者和17例重度DKD患者)的血浆进行miRNA表达分析，发现miR-21-3p在大量蛋白尿DKD患者血浆中表达明显升高。

同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)是一种肿瘤抑制因子，可使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸肌醇(PIP3)去磷酸化，抑制蛋白激酶B(Akt)的磷酸化活性。Kumarswamy等[8]在转化生长因子β(TGF-β)诱导的内皮细胞中观察到miR-21高表达及Akt信号通路激活；过表达miR-21可模拟TGF-β的介导作用，降低内皮标志物血管内皮钙黏蛋白(VE-Cadherin)的表达，增加间充质标志物成纤维细胞特殊蛋白的表达。该研究表明miR-21可通过沉默内皮细胞中的PTEN，以激活Akt介导的EndMT。另外，有报道指出TGF超家族骨成型蛋白7(BMP-7)通过下调miR-21发挥其对DKD纤维化的抑制作用[9]。因此，推测miR-21参与的TGF-β/BMP-7/miR-21/PTEN纤维化调控通路可能为控制DKD中EndMT的有效靶点。对于内皮细胞转化为成纤维细胞后，miR-21是否及如何维持高水平表达，Sun等[10]对大鼠肾成纤维细胞进行了miR-21功能丧失/获得实验，发现下调miR-21可逆转TGF-β介导的程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)下调，而过表达miR-21促进PDCD4降解；PDCD4通过抑制转录因子c-Jun磷酸化阻止活化蛋白1(AP-1)依赖性转录，使成纤维细胞标志物纤连蛋白(FN)和平滑肌肌动蛋白表达增加，促进miR-21维持高表达，形成miR-21/PDCD4/AP-1反馈调节；反馈环中产生的miR-21可以直接降解PTEN，将这种自我促进的反馈环与纤维化机制联系起来，提示miR-21在肾纤维化持续恶化中的作用。然而，有学者认为miR-21在特殊情况下具有肾脏保护作用，整合在肾小管上皮细胞的miR-21可以直接靶向下游PDCD4/核因子-κB(NF-κB)和PTEN/Akt信号途径，发挥抗炎症和抗凋亡作用，减轻败血症引起的肾损伤[11]。

以上研究说明，miR-21具有双重作用：一方面，通过TGF-β/BMP7-miR-21-PTEN、miR-21/PDCD4/AP-1等多途径放大损伤反应并促进肾脏纤维化；另一方面，抑制细胞凋亡和炎症反应使肾脏维持正常机能。miR-21在DKD中的作用机制还有待进一步研究证实。

2 miR-214

大多数情况下，miR-214被认为是骨代谢疾病的关键调控因子[12]。一项关于DKD中相关miRNA的生物信息学分析显示，与正常对照组比较，DKD患者体内的miR-214-3p表达水平明显增高[13]。

2014年，Denby等[14]实施单侧输尿管阻塞实验(UUO)阻断TGF-β/Smad信号通路，小鼠体内miR-214水平未受影响；miR-214抑制剂无法抑制Smad2/3的磷酸化，但能改善UUO引起的肾纤维化。以上结果表明miR-214的促纤维化作用独立于TGF-β/Smad信号通路。随后，Wang等[15]研究发现，miR-214可靶向下调内皮细胞中PTEN表达，提示miR-214可能通过激活PTEN/Akt信号通路介导EndMT。另外，miR-214还参与调节内皮细胞增殖或凋亡。研究表明，miR-214可靶向下调环氧化酶(COX-2)抑制前列腺素E2的表达，减弱硫酸吲哚酚引起的内皮细胞凋亡[16]。在DKD肾纤维化进程中，内皮细胞发生EndMT的同时，肾小管上皮细胞也会受病理刺激发生表型转化。本研究团队曾证实，由成纤维生长因子受体缺陷介导的内皮细胞EndMT可诱导相邻肾小管上皮细胞发生上皮-间充质转化(EMT)[17]。因此，如何阻止肾脏发生EMT也是众多研究者们关注的难题。Bera等[18]在糖尿病小鼠的肾皮质及高糖培养的肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞中发现miR-214表达增加，用PTEN的3′-UTR构建报告基因进行突变研究，确定PTEN为miR-214的直接靶标；抑制miR-214的表达可恢复SM22、α2SMA和Ⅳ型胶原纤维的表达，恢复PTEN水平，改善DKD引起的肾小球肥大。

尽管未得到完全证实，以上实验结果均提示DKD中上调的miR-214可能通过靶向调控PTEN信号通路促进肾脏EndMT纤维化，同时miR-214可调控COX-2介导的内皮细胞氧化应激失活，失活带来的细胞功能紊乱也会引起EndMT的发生，为miR-214的促纤维化作用机制提供了理论依据。

3 miR-125b

miR-125b在心肌纤维化中研究较为广泛。研究表明，心肌发生纤维化时，EndMT转化而来的成纤维细胞的miR-125b表达水平是心脏内皮细胞的4倍；miR-125b靶向结合抗纤维化基因p53的3′-UTR，促进心脏EndMT和成纤维细胞增殖活化[19]。Silambarasan等[20]利用高糖诱导内皮细胞功能障碍与细胞凋亡模拟糖尿病条件下的血管损伤，进行miRNA差异性分析，结果显示miR-125b-1-3p随葡萄糖浓度增加而上调。

Muramatsu等[21]研究发现，miR-125b在低氧或VEGF刺激的内皮细胞中表达明显升高；miR-125b直接与内皮细胞标志物VE-Cadherin mRNA的3′-UTR结合抑制其翻译，影响血管形成。这一结果提示在低氧和细胞因子刺激下，miR-125b可能存在促纤维化作用。长期的高糖环境会使内皮细胞持续受损，炎症因子高水平表达。Zhong等[22]在高糖培养的内皮细胞中进行miRNA差异表达分析，发现表达上调的miR-125b与TNF-α诱导蛋白3(TNFAIP3)的3′-UTR存在结合位点；TNFAIP3通过拮抗激活复合物成分中的K63连接泛素化抑制NF-κB信号，表明miR-125b通过对NF-κB抑制剂TNFAIP3的沉默作用，可间接增加NF-κB表达，促进由后者介导的EndMT进程。

多项研究结果表明，内皮细胞miR-125b水平与葡萄糖含量成正比，miR-125b一方面直接抑制VE-Cadherin的表达，内皮细胞黏附作用被破坏，血管无法维持其通透性；另一方面，miR-125b通过抑制NF-κB、阻遏蛋白活性，间接增强相关信号通路，细胞更容易发生纤维化。

4 miR-217

miR-217位于人类基因组2号染色体，通过不同机制参与肿瘤的增殖、转移、侵袭和耐药[23]。Shao等[24]研究发现，与正常对照组比较，糖尿病患者血清中miR-217表达明显升高，且miR-217水平与糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数、尿蛋白/肌酐比值、血肌酐、血尿素氮、血尿酸、低氧诱导因子1α(HIF-1α)和VEGF表达呈正相关，与抗衰老因子沉默信息调节因子1(Sirt1)表达呈负相关，提示miR-217反映糖尿病患者血糖和抗胰岛素水平的同时，可能通过参与炎症、氧化应激、纤维化和血管生成，影响DKD的发生发展。

有学者发现，Sirt1是miR-217的靶基因，miR-217可通过Sirt1基因3′-UTR中的结合位点抑制Sirt1表达，使内皮细胞功能退化和提前衰老，最终导致血管生成受损[25]。研究证实，Sirt1可通过抑制Smad3的乙酰化水平，参与TGF-β/Smad介导的肾纤维化过程[26]。以上结果提示，miR-217/Sirt1/TGF-β/Smad信号转导通路对EndMT有正向调控作用。与此同时，很多研究表明，miR-217在其他肾脏来源细胞中也表现出促纤维化作用。Shao等[27]发现，在高糖环境下，miR-217在肾小球系膜细胞中表达水平升高，同时伴随Sirt1表达下调和HIF-1α及其下游纤维化因子的生成，从而促进DKD的炎症和纤维化。足细胞的损伤在DKD中发挥关键作用。研究发现，抑制miR-217可恢复肿瘤坏死因子超家族成员11诱导的肾足细胞凋亡，缓解DKD[28]。但也有学者在其他纤维化细胞模型中得出不同的实验结论。如Gao等[29]的报告显示，在TGF-β诱导气道平滑肌细胞增殖和迁移的模型中，miR-217表达下调，而过表达miR-217可抑制TGF-β刺激的细胞增殖、迁移和ECM沉积；结合生物信息学分析、荧光素酶活性检测和RNA蛋白检测结果，证实了纤维化转录抑制因子E盒结合锌指蛋白1的3′-UTR是miR-217的潜在靶标。

以上研究表明，尽管miR-217在不同肾脏细胞中可能呈现差异性表达，但与高血糖及DKD密切相关，并且可能参与调控DKD状态下的EndMT，其具体机制还需进一步探讨。

5 miR-155

miR-155高表达可导致多种恶性肿瘤治疗耐药及不良预后[30]。Beltrami等[31]发现，与没有DKD表现的糖尿病对照组比较，DKD患者尿液样本中miR-155明显升高，miR-155诊断DKD具有较高的特异性及敏感性。

现已证实，肾纤维化调节因子c-ski可与Smad蛋白的Mad同源域2结合，阻止Smad被激活，减弱TGF-β/Smad信号活性。Wang等[32]发现，miR-155可直接靶向c-ski的3′-UTR，抑制c-ski表达；抑制miR-155可恢复TGF-β诱导的细胞EndMT。另外，Chen等[33]研究显示，内皮细胞中Akt1的3′-UTR与miR-155-5p之间存在结合位点，miR-155-5p参与PI3K/Akt信号通路调控。含Src同源性2域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP-1)可将PIP3去磷酸化为磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸，有效终止PI3K途径的下游信号转导。Tang等[34]发现，SHIP-1是miR-155的作用靶点，miR-155下调SHIP-1表达，参与博来霉素治疗产生的EndMT，涉及到的机制包括PI3K/Akt、JAK/STAT3和Smad/STAT等信号通路。

根据以上实验结果可知，miR-155与DKD存在密切关联，可作为DKD诊断及病情监测的有效指标。miR-155从多途径参与EndMT进程，包括抑制内皮细胞增殖、迁移，调控TGF-β/Smad和PI3K/Akt等典型EndMT激活通路等。同时，miR-155也是常见的致癌性miRNA，若代谢调节出现紊乱，会增加多种疾病的发病率。

6 miR-433

miR-433在多种恶性肿瘤中表达下调，通过抑制肿瘤细胞增殖和迁移发挥抑癌作用[35]。miR-433还可以靶向COX-2保护胰岛β细胞免受高糖刺激引起的细胞损伤[36]。然而，在DKD肾纤维化过程中，miR-433却表现为负面作用。Zhu等[37]在链脲佐菌素诱导的DKD大鼠肾组织中观察到miR-433表达上调。

有研究表明，miR-433通过对抑制抗酶抑制因子1(Azin1)活性的抑制形成正反馈回路，放大TGF-β/Smad3信号转导驱动的肾纤维化[38]。γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)是催化抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)合成的关键酶，当GSH稳态改变时，内皮细胞受到活性氧(ROS)的刺激，发生功能障碍和EndMT。有学者利用生物信息学分析确定miR-433为靶向GCLc和GCLm基因3′-UTR的候选miRNA，在内皮细胞中上调miR-433表达观察到GCL、GSH表达下降，细胞氧化应激增强，提示miR-433特异性参与GCL的激活影响GSH合成，拮抗miR-433可抑制GCL活性，缓解TGF-β依赖的肾纤维化[39]。

以上研究表明，miR-433在促进DKD肾纤维化的同时，对高糖诱导的细胞氧化应激也有一定刺激作用，细胞内ROS大量积累直接影响线粒体供能，导致细胞代谢紊乱，进而导致细胞失活。

7 miR-342

miR-342是一种与肥胖相关的miRNA，其过表达会引起代谢紊乱。Wang等[40]发现DKD患者体内miR-342特异性表达上调。有学者用TGF-β诱导内皮细胞EndMT，发现miR-342-5p的表达水平明显升高。内皮糖蛋白(ENG)作为TGF-β信号通路的共受体，可以激活Smad1/5磷酸化，抑制Smad2/3活化，ENG基因的3′-UTR为miR-342的直接靶标；实验还发现，miR-342-5p抑制内皮细胞中VEGF受体(VEGFR)活性，减弱VEGF诱导的Akt磷酸化[41]。这提示miR-342-5p可通过抑制VEGFR和ENG参与TGF-β信号转导，减少内皮细胞增殖、迁移，增加EndMT发生的可能。

8 miR-199a

miR-199a存在两种形式，分别为miR-199a-3p和miR-199a-5p，这两种miRNA分别调节各种细胞的活性，参与相应的生理病理过程。有学者发现，与健康对照组相比，miR-199a在糖尿病患者血浆中表达明显升高[42]。微囊蛋白1(CAV1)作为一种膜内蛋白，可通过调节c-Jun N端激酶途径抑制TGF-β诱导的成纤维细胞ECM，发挥抗增殖、抗纤维化作用。有实验人员利用辐射诱导内皮细胞发生EndMT，发现纤维化因子Snail被激活。而miR-199a-5p作为Snail的下游介质，可直接靶向成纤维细胞中CAV1基因的3′-UTR，参与纤维化过程[44,45]。与其他miRNA不同，miR-199a抑制内皮细胞和成纤维细胞同时具备的CAV1，一方面影响内皮细胞膜过滤作用，促进DKD蛋白尿；另一方面影响成纤维细胞的增殖，促进肾纤维化。

综上所述，在DKD中表达上调的miRNA，在DKD肾纤维化病程中起到重要的调节作用，其可能依赖于经典的TGF-β信号通路或其他非典型信号通路调控EndMT的发生发展。DKD的发病机制复杂，临床治疗效果不理想，miRNA检测有助于反映疾病的严重程度，而且，基于miRNA的靶向治疗可以提供新的治疗策略，脂质体或纳米颗粒等新的载体可以有效控制剂量及不良反应，有效延缓肾纤维化进程。尽管EndMT的具体机制有待阐明，miRNA在DKD靶向治疗中的应用也面临着巨大挑战，但随着大量体内外实验及临床样本分析的出现，我们将进一步了解miRNA与EndMT、肾纤维化之间的联系，为肾脏疾病的发生发展和预后评估提供更多的证据支撑。