中草药饲料添加剂对梅花鹿血清免疫球蛋白和免疫机能影响的研究

田来明，田 鑫，崔鹤馨，权心娇，李 男，付晓霞

长春市农业科学院，吉林长春 130000

中草药饲料添加剂能够向动物体内的微生物菌群提供营养底物，以此来改善胃肠环境和菌群结构，进而调控胃肠发酵、减少乳酸盐的产生、稳定pH值，促进整个肠道乳酸利用菌、纤维素菌等有益菌的繁殖，提高其浓度及活力，从而促进动物对营养物质的消化、吸收和利用、增加采食量、改善饲料利用率、提高生产性能；中草药饲料添加剂也可影响动物的免疫系统，其能够抑制和吸附肠道内病原菌并能够调节非特异免疫防御机制，同时能够很好的防止毒素吸收，阻止病原性微生物及毒素在胃肠黏膜表面上的附着，同时可刺激机体产生特异性免疫,形成免疫防御机制；中草药饲料添加剂不仅可激发、增强机体的免疫力和抗病力，还可维护胃肠道微生态平衡、选择性促进胃肠道有益菌群增殖,还可抑制有害菌的繁殖。中草药饲料添加剂最初在反刍动物中应用是用做补充饲料。随着食品安全性的提高和人们对绿色安全性食品的追求，中草药饲料添加剂因其无毒、无残留、无污染且不产生耐药性等优点，在畜牧业生产中得到广泛应用。本试验主要是应用中草药饲料添加剂在梅花鹿生产中应用，研究其对梅花鹿免疫机能的影响。

1 材料与方法

1.1 梅花鹿要求

选择体况、体重相近，体质外貌、遗传相近、出生日期相同或相近，健康的公鹿32头。

1.2 试验时间和地点

试验于2018年8月10日～2019年8月10日在吉林省长春市某试验鹿场基地进行。

1.3 试验仪器、药品及试剂

中草药饲料添加剂：板蓝根、淫羊藿、党参、黄芪、白术，比例为2:1:2:2:2；Array360特种蛋白分析仪；流式细胞仪；PBS等。

1.4 试验设计

采用单因子试验设计，用不同中草药饲料添加剂比例进行饲喂。将32头3岁龄梅花鹿随机分成4个组：A、B、C、D、每组8头，A组作为对照组，饲喂不添加中草药饲料添加剂的全价饲料，B、C、D组分别喂3个不同中草药饲料添加剂梯度的全价饲料，B组0.1%（占基础日粮比重），C组0.2%，D组0.5%。每组除中草药饲料添加剂的添加水平不同，其他水平日粮基本相同。基础日粮配方及营养水平见表1。

表1 梅花鹿公鹿日粮配方及成分比

1.5 饲养管理

按鹿场常规饲养管理程序进行，预试期3 d，同时进行消毒、预防接种、驱虫等。试验鹿每日投喂3次，鹿只自由饮水,每日注意观察采食情况，按鹿场正常程序进行免疫，试验期5个月。

1.6 指标测定及方法

试验前2～3 天,采集试验组及对照组的梅花鹿血液,然后连续投喂中草药饲料添加剂,在二茬茸生长结束时停止饲喂。这期间应分别采集头茬茸和二茬茸的血液。将一部分血液用EDTA凝装于试管中,用于检测T、B细胞,另一部分应为不抗凝,用于免疫球蛋白IgA、IgG、IgM的测定。采集后立即送往实验室，4 000 r/min离心10 min，收集血清于1.5 mLEP管中，-20 ℃低温保存，待测，每组采血样各3份。

1.6.1血清生化指标测定

试验对梅花鹿生茸前期、生茸期及再生茸时期的血清中免疫球蛋白IgA、IgG、lgM进行了测定,从而研究中草药饲料添加剂对免疫球蛋白IgA、lgG、IgM的影响。应用Array360特种蛋白分析仪器测定，其原理是在特殊缓冲液中抗原抗体快速形成抗原抗体复合物,使反应液浊度。在反应液中要求抗体必须过剩,使其形成抗原抗体复合物随抗原量增加而增加,所以反应液的浊度也将增加,然后标准品对照分析,即可计算出未知蛋白的含量。

1.6.2 淋巴细胞的检测

利用流式细胞术检测T、B淋巴细胞的含量。

1.6.2.1 淋巴细胞悬液的制备

采集茸血2 mL,经EDTA抗凝,加入0.85%Nacl溶液5 mL。将淋巴细胞分离液2 mL,置于锥形离心管中,取1～1.5 mL全血混悬液加入淋巴细胞分离液上层,8 000r/min离心15 min。取淋巴细胞层,加入PBS4 mL混匀洗涤,l 000 r/min离心10 min,弃上清液,重复一次后,加入0.5 mLPBS缓冲液混匀,此液为单淋巴细胞悬液。

1.6.2.2 免疫荧光标记

取50 µL单淋巴细胞悬液，加入50 µL标有荧光素的犬抗鼠单克隆抗体液,1 000 r/min离心，弃上清液,加入50 µLFITC-犬抗鼠IgG液,37 ℃水溶避光，加入2 mLPBS混匀,离心10 min,弃上清液,重复一次后加入1 mLPBS缓冲液混匀。

1.6.2.3 检测

用FACS440型流式细胞仪上机检测。

1.7 统计方法

采用spss19.0软件进行分析，所得结果以平均值±标准差表示，其中p＞0.05为差异不显著，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 中草药对血清免疫球蛋白的影响

表1 生茸前期血清免疫球蛋白含量变化 µg/mL

试验组B、C、D及对照组的血清免疫球蛋白含量，运用单因子方差分析及Duncan多重比较，IgA、IgG、lgM各组间差异不显著（p＞0.05）。

表2 头茬茸试验组与对照组血清免疫球蛋白的含量

试验组B、C、D及对照组的血清免疫球蛋白含量，IgA值D与C组间比较IgA值差异不显著（p＞0.05），D、C组与B和A组间比较差异显著（p＜0.05），B与A组间比较值差异显著（p＜0.05），B、C、D各组IgA值明显高于对照组A。IgG值B与C组间比较IgG值差异不显著（p＞0.05），B与C组和D与A间比较IgG值差异显著（p＜0.05），D与A间比较IgG值差异显著（p＜0.05），B、C、D各组明显高于对照组A。lgM值D与C组间比较lgM值差异不显著（p＞0.05），D与A、B组间比较lgM值异显著（p＜0.05），C与A、B组间比较lgM值异显著（p＜0.05）, A与B组间比较异显著（p＜0.05）。

表3 二茬茸试验组与对照组血清免疫球蛋白的含量a

试验组B、C、D及对照组的血清免疫球蛋白含量，IgA值D与B组间比较IgA值差异不显著（p＞0.05），D、B组与C和A组间比较差异显著（p＜0.05），A与C组间比较IgA值差异显著（p＜0.05）。IgG值D与B组间比较差异不显著（p＞0.05），D、B组与C和A组间比较IgG值差异显著（p＜0.05），A与C组间比较IgG值差异显著（p＜0.05）。IgM值B与C组间比较lgM值差异不显著（p＞0.05），D与A组间比较差异显著（p＜0.05）。

2.2 中草药饲料添加剂对血浆T、B淋巴细胞含量的影响

2.2.1 生茸前期试验组与对照组血浆T、B淋巴细胞的含量

对于试验组B、C、D及对照组A的Cd3（T）、Cd19（B）值,运用单因子方差分析,p＞0.05,说明试验组B、C、D及对照组A的（Cd3）各组间差异不显著，p＜0.05，说明各组间差异显著，本试验生茸前期试验组与对照组血浆T、B淋巴细胞的含量差异不显著。

2.2.2 与对照组血浆T、B淋巴细胞的含量

表4 生茸前期试验组与对照组免疫细胞含量(x106/mL)

表5 头茬茸试验组与对照组免疫细胞含量(x106/mL)

头茬茸T细胞试验组与对照组相比差异显著（p＜0.05），B、C、D各组明显高于A组，B组与C、D组相比差异显著（p＜0.05），C与D组间差异不显著（p＞0.05）；B细胞头茬茸试验组与对照组相比差异显著（p＜0.05），B、C、D各组明显高于A组，B与C组间比较差异不显著（p＞0.05），C与D组间差异也不显著（p＞0.05），但B与D组间差异显著。

2.2.3 二茬茸试验组与对照组血浆T、B淋巴细胞的含量

表6 二茬茸试验组与对照组免疫细胞含量(x106/mL)

T细胞二茬茸试验组与对照组相比，A与B组差异不显著（p＞0.05），D与C组比较差异不显著（p＞0.05），但A与B组和D与C组相比差异显著（p＜0.05）；B细胞与对照组相比差异显著（p＜0.05），B、C、D各组明显高于A组，但B、D、C组间无显著差异（p＞0.05）。

3 讨论

中草药饲料添加剂种类很多,生产上要注意中草药类型的选择。作为理想的中草药添加剂应具备：①对动物和人具有一定的安全性，无健康危害；②适应外界环境如饲料加工过程中的热、干燥、挤压和振动等；③对消化道有益微生物的活性具有促进作用，能够提高机体的免疫力等。

3.1 中草药对梅花鹿血清蛋白影响

免疫系统有免疫器官、免疫细胞和免疫因子组成，抗体免疫球蛋白分为IgA、IgG、IgM等。本试验仅对中草药添加剂饲喂养后IgA、IgG、IgM免疫球蛋白在血清中的含量变化进行研究。

IgA是常规构造的免疫球蛋白，在动物体的外分泌中IgA是主要的免疫球蛋白,它在保护肠道、呼吸道和泌尿道等抵抗微生物的入侵方面有着极其的重要性。同时IgG是血清中的浓度最高的一类免疫球蛋白,在抗体介导的防御机制中起主要作用，有抗细菌、病毒、外毒素等多种活性；IgG能够调理、凝集和沉淀抗原；IgM是免疫应答中的重要免疫球蛋白,在激活补体、调理作用、中和病毒等方面比IgG要有效得多。

试验组与对照组各时期血清免疫球蛋白的含量比较见图1。

图1a 各试验组与对照组IgA含量比较

图1b 各试验组与对照组IgG含量比较图1c 各试验组与对照组IgM含量比较

3.1.1 生茸前期试验组与对照组免疫球蛋白的含量

本试验研究结果，在生茸前期，血清IgA、IgG、IgM的含量各组间差异不显著（p＞0.05）。

3.1.2 头茬茸试验组与对照组免疫球蛋白的含量及比较

头茬茸时期，IgA、IgG、IgM的含量高于对照组，B、C、D组与对照组比较差异显著（p＜0.05）；IgA的含量C组明显高于其他各组，B、D组高于对照组，但B、D组间IgA的含量差异不显著；IgG的含量B、C、D组高于对照组，各组间差异显著（p＜0.05），B、C组间差异不显著（p＞0.05），B、C组高于D组；IgM的含量B、C、D组高于对照组，差异显著（p＜0.05），C、D组间差异不显著（p＞0.05），CD组含量高于B组，且差异显著（p＜0.05）。

3.1.3 免疫球蛋白的含量在二茬茸试验组与对照组的比较

二茬茸时期，IgA、IgG、IgM的含量高于对照组，B、C、D组与对照组比较差异显著（p＜0.05）。二茬茸时期，IgA、IgG、IgM的含量高于对照组，B、C、D组与对照组比较差异显著（p＜0.05）。IgA的含量C组高于B、D组，差异显著（p＜0.05），B、D组间比较差异不显著（p＞0.05）；IgG的含量C组高于B、D组，差异显著（p＜0.05），B、D组间比较差异不显著（p＞0.05）；IgM的含量D组高于B、C两组，差异显著（p＜0.05），B、C组间比较差异不显著（p＞0.05）。通过试验可看出，在梅花鹿茸前期饲喂的中草药添加剂，血清IgA、IgG、IgM的含量较对照组差异显著(p＜0.05),可见中草药饲料添加剂对IgA、IgG、IgM的含量有显著的增加作用,它可以提高动物机体免疫功能。

3.2 中草药饲料添加剂对血浆T、B淋巴细胞含量的影响

中草药饲料添加剂含有丰富的营养物质,同时也可稳定胃肠道微生物菌群平衡，保证动物纤维素和矿物质的消化能力,提高免疫力和吸附致病因子。动物机体T、B淋巴细胞是重要的免疫细胞,T、B细胞可反映动物机体免疫机能的强弱。试验组与对照组血浆T、B淋巴细胞含量的比较见图2。

图2a 各试验组与对照组血浆T淋巴细胞含量比较

图2b 各试验组与对照组血浆B淋巴细胞含量比较

3.2.1 生茸前期试验组与对照组血浆T、B淋巴细胞的含量及比较

本试验结果表明,饲料中没有添加中草药饲料添加剂的组，试验组与对照组间的T、B淋巴细胞数量差异不显著(p<0.05)。

3.2.2 头茬茸和二茬茸血浆T、B淋巴细胞的含量及比较

试验结果表明,头茬茸血浆T淋巴细胞含量B、C、D试验组高于对照组A, 各组与A组间比较差异显著（p＜0.05）。T细胞二茬茸试验组与对照组相比，A与B组差异不显著（p＞0.05），D、C和A组比较差异显著（p＜0.05）；二茬茸试验组与对照组T细胞相比，A与B组差异不显著（p＞0.05），D与C组差异不显著（p＞0.05），但A与B组和D与C组差异显著（p＜0.05）；B细胞二茬茸试验组与对照组相比差异显著（p＜0.05），B、C、D各组明显高于A组，但B、D、C组间无显著差异（p＞0.05）。通过对比可看出中草药饲料添加剂同日粮共同饲喂梅花鹿可以提高梅花鹿T、B细胞含量，增加动物机体免疫功能，预防疾病的发生。应用中草药技术开发的饲料添加剂具有提供营养和促进动物生长的作用,使其能够成为一类优质的饲料添加剂。随着科技水平和加工技术的提高中草药饲料添加剂的应用将会越来越受到人们的重视，并将在动物养殖过程中大放光彩。

参考文献：略